堿性磷酸酶（AKP/ALP）活性測定試劑盒使用說明書

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：                           
AKP/ALP是一種含鋅的糖蛋白酶，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化合物。AKP/ALP廣泛分布于人體各臟器中，以肝臟為主。
 
測定原理：
在堿性環(huán)境中，AKP/ALP催化磷酸苯二鈉生成游離酚；酚與4-氨基安替比林和鐵氰化鉀反應紅色亞醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通過測定510 nm吸光度增加速率，來計算AKP活性。
 
自備儀器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
 堿性磷酸酶（AKP/ALP）活性測定試劑盒說明書​
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體×1瓶，4℃避光保存，未變成藍綠色之前均可使用。
標準品：液體×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚標準液，4℃保存。
 
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• 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，4℃、8000g離心10min，取上清液待測。
• 細菌或細胞：按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
• 血液可直接測定，或者適當稀釋后測定。

測定步驟：
1. 分光光度計預熱30min，調節(jié)波長到510 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑三置于37℃水浴中預熱30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸餾水，200μL試劑二，200μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四600μL，混勻后于510 nm測定吸光度，記為A空白管。
4. 標準管：取EP管，加入20μL標準品，200μL試劑二，200μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四600μL，混勻后于510 nm測定吸光度，記為A標準管。
5.對照管：取EP管，加入20μL上清液，200μL蒸餾水，200μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四600μL，混勻后于510 nm測定吸光度，記為A測定管。
 
6. 測定管：取EP管，加入20μL上清液，200μL試劑二，200μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四600μL，混勻后于510 nm測定吸光度，記為A測定管。
注意：空白管和標準管只需測定一次。每個測定管設一個對照管。
 
AKP/ALP活性計算：

• 血液中AKP/ALP活力計算

活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產生1μmol酚定義為1個酶活單位。
AKP/ALP活力(μmol/min /mL)= [C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總] ÷V樣÷T=6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)

• 組織、細菌或細胞中AKP/ALP活性計算

（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產生1 μ mol酚定義為1個酶活單位。
AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T=6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化產生1 μ mol酚定義為1個酶活單位。
AKP/ALP(μmol/min/g 鮮重)=[C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管) ÷W
（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算
活性單位定義：37℃中每10⁴個細菌或細胞每分鐘催化產生1 μ mol酚定義為1個酶活單位。AKP/ALP (μmol/min/10⁴ cell)= [C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T= 6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數(shù)量
 C標準品：2μmol/mL；V反總：反應體系總體積（mL），1020μL=1.02 mL； V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），0.020mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間（min），15 min。

注意事項：
1.試劑二、試劑三和試劑四均需避光保存。
2.試劑四變藍綠色后不能再使用。
3.加入試劑四后必須立即混勻，否則顯色不完全。