喻德躍教授團(tuán)隊(duì)采用磷酸化組揭秘大豆開花和抗蟲之間的協(xié)調(diào)關(guān)系

光周期敏感的植物，如大豆，在整個(gè)生長(zhǎng)期都面臨食葉性昆蟲的危害，而開花期經(jīng)常與害蟲高發(fā)期一致。目前，尚不清楚植物如何協(xié)調(diào)其開花和抗蟲性之間的關(guān)系。

2022年5月31日，國(guó)際頂尖植物期刊Plant Physiol（IF 8.34）在線發(fā)表了南京農(nóng)業(yè)大學(xué)喻德躍教授團(tuán)隊(duì)李霄等老師的創(chuàng)新研究成果“CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE38 regulates flowering time and common cutworm resistance in soybean”。該研究揭示了大豆GmCDPK38在調(diào)控開花時(shí)間和抗蟲性中的雙重功能及其在大豆馴化中的進(jìn)化規(guī)律，為植物開花與抗蟲性的研究方向提供了新思路。其中中科新生命提供了磷酸化蛋白質(zhì)組檢測(cè)服務(wù)。

研究材料

大豆Jack（WT植株）、gmcdpk38突變體和攜帶GmCDPK38 Hap2或Hap3單倍型的大豆材料

 

技術(shù)路線

步驟1：光周期調(diào)控GmCDPK38的表達(dá)；

步驟2：GmCDPK38的遺傳變異與大豆開花時(shí)間和對(duì)斜紋夜蛾（CCW）的抗性相關(guān)；

步驟3：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的GmCDPK38 Hap3靶向突變導(dǎo)致大豆開花延遲，并增強(qiáng)對(duì)CCW的抗性；

步驟4：利用磷酸化蛋白質(zhì)組篩選GmCDPK38的下游底物；

步驟5：RNA-seq分析揭示GmCDPK38影響的基因表達(dá)；

步驟6：gmcdpk38突變體中多種代謝產(chǎn)物的積累增加；

步驟7：GmCDPK38翻譯后調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸合酶；

步驟8：GmCDPK38是一個(gè)馴化基因，抗性的Hap2可能是一個(gè)人工選擇靶點(diǎn)。

 

研究結(jié)果

1. 光周期調(diào)控GmCDPK38的表達(dá)

GmCDPK38是鈣依賴性蛋白激酶第IV亞家族成員。通過(guò)光周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GmCDPK38在長(zhǎng)日照（LD）條件下的表達(dá)水平大于短日照（SD）。隨后通過(guò)分析GmCDPK38的日表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在LD條件下，GmCDPK38的表達(dá)量在白天減少，夜間增加。在SD條件下觀察到該基因存在相同的表達(dá)模式，但其轉(zhuǎn)錄的幅度和豐度低于LD。這些結(jié)果表明，GmCDPK38的表達(dá)受光周期調(diào)節(jié)，在LD條件下表達(dá)量更高（圖1）。

圖1 GmCDPK38表達(dá)分析

 

2. GmCDPK38的遺傳變異與大豆開花時(shí)間和對(duì)斜紋夜蛾（CCW）的抗性相關(guān)

分析了272株栽培大豆中的GmCDPK38序列，在至少7種環(huán)境中，18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與開花時(shí)間的變化顯著相關(guān)。其中，含單倍型2（Hap2）的大豆的開花時(shí)間明顯晚于含Hap3。此外，具有晚花Hap2的栽培大豆對(duì)CCW更具抗性。在LD和SD條件下，Hap2中的GmCDPK38表達(dá)顯著低于Hap3，其啟動(dòng)子活性也低于Hap3。綜上，GmCDPK38可能在花期和抗蟲性方面發(fā)揮作用（圖2）。

圖2 大豆GmCDPK38單倍型分析

 

3.  CRISPR/Cas9介導(dǎo)的GmCDPK38 Hap3靶向突變導(dǎo)致大豆開花延遲，并增強(qiáng)對(duì)CCW的抗性

大豆品種Jack中的GmCDPK38序列屬于Hap3。比較野生型（WT）Jack植株和gmcdpk38突變體的開花時(shí)間，發(fā)現(xiàn)突變體的開花時(shí)間晚于WT植株。此外，在LD條件下評(píng)估gmcdpk38突變體和WT植株的抗蟲性，實(shí)驗(yàn)表明GmCDPK38的突變提高了大豆對(duì)CCW的抗性（圖3）。

圖3 T₃ gmcdpk38突變體的表型鑒定

 

4. 利用磷酸化蛋白質(zhì)組篩選GmCDPK38的下游底物

通過(guò)定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析檢測(cè)WT植株和gmcdpk38突變體中的磷酸蛋白。數(shù)據(jù)顯示了一系列可能的GmCDPK38激酶下游底物，推斷GmCDPK38可能通過(guò)影響這些蛋白質(zhì)的磷酸化來(lái)介導(dǎo)大豆開花和抗蟲性（圖4）。

圖4 磷酸蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)總結(jié)

 

5.  RNA-seq分析揭示GmCDPK38影響的基因表達(dá)

通過(guò)RNA-seq鑒定了大量與抗性和開花相關(guān)的表達(dá)基因。GmCDPK38突變誘導(dǎo)大多數(shù)開花抑制基因的表達(dá)，而gmcdpk38突變體中大多數(shù)開花促進(jìn)基因表達(dá)下調(diào)。此后通過(guò)RT-qPCR證實(shí)這些基因表達(dá)與RNA-seq結(jié)果一致（圖5）。
 

圖5 GmCDPK38誘導(dǎo)T₃ gmcdpk38突變體基因表達(dá)的變化

 

6. gmcdpk38突變體中多種代謝產(chǎn)物的積累增加

對(duì)WT和gmcdpk38突變體進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析。在LD下42天，與WT相比，突變體中65.28%的代謝產(chǎn)物含量顯著增加，其中包含16個(gè)不同的化合物類別。大多數(shù)差異代謝產(chǎn)物，包括類黃酮、苯丙烷、多酚、酚酰胺、生物堿和萜類，都是已知的植物內(nèi)源性防御代謝物。SD下29天的代謝物水平下降的比例（48.93%）高于LD下42天。綜上，GmCDPK38的突變誘導(dǎo)多種代謝物的積累，尤其是在LD條件下（圖6）。

圖6 T₃ gmcdpk38突變體各類差異代謝產(chǎn)物數(shù)量

 

7. GmCDPK38翻譯后調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸合酶

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示S-腺苷甲硫氨酸合酶GmSAMS1僅在WT組中發(fā)生磷酸化。通過(guò)酵母雙雜交（Y2H）和雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GmCDPK38與GmSAMS1互作并可能導(dǎo)致GmSAMS1磷酸化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與防御相關(guān)的S-腺苷甲硫氨酸合酶在gmcdpk38突變體中在翻譯后上調(diào)表達(dá)，表明GmCDPK38突變?cè)鰪?qiáng)了大豆對(duì)CCW的抗性（圖7）。

圖7 T₃ gmcdpk38突變體S-腺苷甲硫氨酸合酶翻譯后上調(diào)

 

8. GmCDPK38是一個(gè)馴化基因，抗性的Hap2可能是一個(gè)人工選擇靶點(diǎn)

Hap2在栽培大豆中出現(xiàn)的頻率高于野生大豆，多出現(xiàn)在低緯度地區(qū)，而Hap3在野生大豆中出現(xiàn)的頻率更高，主要分布在高緯度地區(qū)。Hap2在主栽品種的高頻出現(xiàn)表明該等位基因可能是人工馴化的結(jié)果。通過(guò)計(jì)算馴化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)GmCDPK38在大豆馴化中受到選擇（圖8）。
 

圖8 GmCDPK38在大豆馴化中受到選擇

 

小編小結(jié)

本研究利用基因編輯、磷酸化修飾組學(xué)、代謝組學(xué)等分析證實(shí)鈣依賴性蛋白激酶GmCDPK38在協(xié)調(diào)大豆開花時(shí)間調(diào)節(jié)和抗蟲性方面起著雙重作用。GmCDPK38在野生大豆中具有豐富的遺傳多樣性，可能是在大豆馴化過(guò)程中選擇的。