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FlexStation3多功能酶標(biāo)儀在鑒定阻斷hERG通道化合物中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：2633　發(fā)布日期：2022-4-14　 來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
簡(jiǎn)介
藥物誘導(dǎo)的人類 hERG 離子通道阻滯與患者潛在的致死性室性快速心律失常的易感性有關(guān)。近年來(lái)，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)的一些藥物由于對(duì) hERG 的脫靶作用而退出市場(chǎng)。因此，在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期階段，迫切需要鑒定能夠阻斷 hERG 通道的化合物。在此，我們展示在 FlexStation 3 多功能酶標(biāo)儀上，一種新的
鉀離子通道檢測(cè)試劑盒研究 hERG 化合物活性的用途。這種分析方法利用了鉈離子 (Tl+ ) 的滲透性，通過鉀離子通道進(jìn)入胞質(zhì)，然后被一種新型熒光指示劑檢測(cè)到。7 種參照的 hERG阻滯劑在中等 通 量 細(xì)胞試 驗(yàn)中進(jìn) 行檢 測(cè)，并將 FLIPR TetraSystem 和 IonWorks Barracuda Plus Automated Patch Clamp System 收集的數(shù)據(jù)值進(jìn)行比較。
 
優(yōu)點(diǎn)
•細(xì)胞水平的鉀離子通道活性的功能測(cè)定
•均相免洗特性可降低孔間差異并簡(jiǎn)化操作流程
•相比于非均質(zhì)化實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)展了信號(hào)窗口
圖 1 FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒的原理。
 
材料和方法
劑。在起始的染料加樣步驟，鉈離子指示劑以乙氧基甲基酯(AM) 的形式通過被動(dòng)擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞質(zhì)的酯酶可切割 AM 酯并釋放其活性熒光構(gòu)型。此外，一種具有專利的掩蔽染料應(yīng)用于細(xì)胞外以降低背景熒光。細(xì)胞被鉀離子和鉈離子的混合物或鉈離子存在下的配體刺激，可以激活鉀離子通道。熒光信號(hào)的增加表示鉈離子流入細(xì)胞內(nèi)，確切地說是通過鉀通道流入，因此顯示了鉀離子通道功能性的活性 測(cè) 量。FLIPR Potassium Assay Explorer Kit (MolecularDevices Cat# R8222) 試劑盒包含鉈離子敏感的染料，掩蔽染料用于均質(zhì)化操作，200 mM 硫酸鉀，50mM 硫酸鉈，5x 無(wú)氯緩沖液，HBSS + 20 mM HEPES 緩沖液。此試劑盒支持 10 塊96 孔或 384 孔板。實(shí)驗(yàn)流程如圖 2。

制備化合物
化合物的疏水性質(zhì)影響表觀效力值，可能是由于與實(shí)驗(yàn)器具的非特異性結(jié)合。在這項(xiàng)研究中，化合物首先在 100% DMSO中稀釋，然后在檢測(cè)前立即與 HBSS + 20 mM HEPES 緩沖液一同轉(zhuǎn)移至玻璃內(nèi)襯的聚丙烯板中。

實(shí)驗(yàn)流程
人 hERG 離子通道基因Kv11.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，由ChanTest Corporation (Cleveland, OH) 公司提供。在實(shí)驗(yàn)前兩天，以 25000 個(gè)細(xì)胞 / 孔的密度將細(xì)胞種在黑色透明底的 96 孔板中，加入含有選擇抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基并在 37℃和 5% CO2 環(huán)境下孵育。在實(shí)驗(yàn)前的 24 小時(shí)，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基換成含有四環(huán)素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)前的 4 小時(shí)，將細(xì)胞孵育溫度從 37° C 切換到 28℃，以增強(qiáng)細(xì)胞膜上 hERG 離子通道的表達(dá)。微孔板細(xì)胞與染料一起在室溫下避光孵育 1 小時(shí)。
 
藥理學(xué)分析時(shí)，首先加入 hERG 通道阻滯化合物，室溫孵育30 分鐘。在 FlexStation 3 酶標(biāo) 儀檢 測(cè)時(shí)，添加先前優(yōu)化過的刺激緩沖液至每個(gè)孔中。在 SoftMax Pro 軟件中設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng) 485nm, 發(fā) 射 波長(zhǎng) 538nm。每 列的信號(hào)采 集 大 約 120秒， 間 隔 1.52 秒。 為了 進(jìn) 行 對(duì) 比，使 用 FluxOR Assay Kit(Life Technologies) 試劑盒，按其實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行平行試驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析在 SoftMax Pro 軟件和 GraphPad Prism 軟件中完成。
 
通 過確定刺激 hERG 通 道 所需的鉈 和鉀的最佳濃 度 進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)方法的開發(fā)。在微孔板中測(cè)試不同濃度組合的硫酸鉀和硫酸鉈的刺激緩沖液，鉈離子和鉀離子緩沖液使 用 1x 無(wú)氯 緩沖液稀釋。硫酸鉈和硫酸鉀每摩爾有兩倍量的陽(yáng)離子，因此我們認(rèn)為它們的陽(yáng)離子濃度是各自濃度的 2 倍。檢測(cè)時(shí)，將刺 激緩沖液加入孔中的細(xì)胞比較不同濃度組合的信號(hào)軌跡，以確定提供最大信號(hào)的最佳濃度組合。使用 FLIPR TetraSystem 得到的數(shù)據(jù)顯示，能夠刺激 hERG 并提供最大信號(hào)的最優(yōu)或最終的鉈離子濃度是 1 mM，鉀離子濃度時(shí) 10 mM。
圖 2 在 FlexStation 3 酶標(biāo)儀上，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒的工作流程。
圖 3 在 IonWorks Barracuda System 上的電生理實(shí)驗(yàn)。將化合物以 3x 的濃度加入 1% DMSO 中，再在孔中與緩沖液混合，稀釋至終濃度為 1x 的化合物于 0.33% DMSO�；衔锓跤� 5 分鐘后，按如下電壓操作，+40 mV 刺激一秒，隨后一秒至 -50 mV，測(cè)量峰值尾電流。
圖 4 阻 斷 hERG通道活性的代表性化合物的濃度響應(yīng)曲線。在FlexStation 3 酶標(biāo)儀上收集得到數(shù)據(jù)。
圖 5 FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒的結(jié)果與競(jìng)爭(zhēng)者試劑盒相比較。
圖 6 FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒的信號(hào)動(dòng)態(tài)范圍與競(jìng)爭(zhēng)者試劑盒相比較。4 uM 特非那定作為陰性對(duì)照，刺激緩沖液作為陽(yáng)性對(duì)照。FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒的 Z factor = 0.67，n = 8；競(jìng)爭(zhēng)試劑盒的 Z factor = 0.43，n = 8。
可與如下的 Molecular Devices 產(chǎn)品兼容。

表 1 FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒，在 FlexStation 3 酶標(biāo)儀、FLIPRTetra System、IonWorks Barracuda System 三套系統(tǒng)上得到的 IC50值進(jìn)行對(duì)比。
表 2 FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒與競(jìng)爭(zhēng)試劑盒的 IC50 結(jié)果比較。
 
電生理
為了進(jìn) 行比較，從 IonWorks Barracuda 全自動(dòng)膜 片鉗系統(tǒng)獲得了同一組 hERG 通道阻斷劑的 IC
50 值 ( 圖 3 )。為了捕獲化合物使用依賴性的效應(yīng)，在化合物添加前后，施加 5 次 0.1Hz 的電壓。hERG 尾電流在第五次掃描時(shí)的峰值振幅被用來(lái)測(cè)量該化合物的效應(yīng)。

 
結(jié)果
在 FlexStation 3 酶標(biāo)儀上使用 FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒鑒定七個(gè)已知的 hERG 通道阻滯劑�；衔锏臐舛软憫�(yīng)曲線 如 圖 4。 在 FLIPR Tetra System、IonWorks BarracudaSystem 兩套系統(tǒng)上得到的 IC50值 進(jìn) 行對(duì)比，如表 1 所示。這三種檢測(cè)系統(tǒng)中的 IC50 值在半對(duì)數(shù) (1/2log) 范圍內(nèi)有較好的相關(guān)性，化合物效價(jià)的排序保持不變。

另外，四 個(gè)化合物被用來(lái)評(píng)估基于鉈離子的參照實(shí)驗(yàn)劑盒( FluxOR 鉀離子通道實(shí)驗(yàn))的性能( 圖 5 )。除了西沙必 利 (cisapride) 之外，實(shí)驗(yàn)獲得的IC50值都是相似的，如表 2 所示。 西沙必利通過FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒得到的IC50 值 更 接 近 于 FLIPR Tetra System、IonWorksBarracuda System 兩套系 統(tǒng) 得到的 值。FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒提供的平均信號(hào)窗口約為 225% ( % 確定為基線 )明顯高于 FluxOR 試劑盒的平均值 90%，每組 8 個(gè)樣本。為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，能完全阻斷 hERG 通道響應(yīng)的 4uM 特非那定 (terfenadine) 作為陰性 對(duì)照，陽(yáng)性 對(duì)照選 擇引起 最 大的hERG 通道響應(yīng)的刺激緩沖液。FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒獲得的更高 Z 因子得益于更低的孔間變異性和更寬的信號(hào)窗口 ( 圖 6 )。這可能是因?yàn)?FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒是一種真正的均質(zhì)性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，不需要清洗步驟或更換介質(zhì)，因此具有更低的孔間變異性。
結(jié)論
 
FLIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒使用均質(zhì)化、無(wú)需清洗的操作方案來(lái)測(cè)量鉀離子通道的功能活性。此研究中，我們使用一系列的參照的 hERG 阻滯劑來(lái)證明 FlexStation 3 酶標(biāo)儀的獲得的結(jié)果與使用 FLIPR Tetra System 和電生理方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有強(qiáng)烈的相關(guān)性。
 
另一組實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測(cè)試劑盒相比于競(jìng)爭(zhēng)試劑盒產(chǎn)品，顯示了明顯更大的試驗(yàn)窗口和更高的 Z 因子。改進(jìn)的試驗(yàn)質(zhì)量聯(lián)合 FlexStation 3 多功能酶標(biāo)儀的中等通量能力或者 FLIPR Tetra System 的高通量能力，能夠在藥物發(fā)現(xiàn)的早期過程為 hERG 的特征分析提供一個(gè)有力的平臺(tái)。
 

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參考文獻(xiàn)
1. Characterization of hERG channel blockers using the FLIPR Potassium Assay Kit, Application Note, 2015.
2. D. Rampe, et al, A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG, FEBS Letters 1997; 417(1): 28-32.
3. Karen Cook, James L. Costantin, and Xin Jiang, Validation of the IonWorks Barracuda System for hERG Ion Channel Assay, Application Note, 2011
發(fā)布者：美谷分子儀器（上海）有限公司
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