人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存及其應(yīng)用

　　一、背景

　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是從臍帶靜脈中分離出來(lái)的原代細(xì)胞。這種細(xì)胞是研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的模型系統(tǒng)，研究相關(guān)的低氧、炎癥、氧化應(yīng)激、感染反應(yīng)以及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應(yīng)用。TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活（一種炎性反應(yīng)），并導(dǎo)致VCAM-1/CD106等細(xì)胞黏附分子上調(diào)，這些上調(diào)可使用熒光標(biāo)記抗體和細(xì)胞成像進(jìn)行定量。

　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是采用新鮮的健康產(chǎn)婦新生兒臍帶，采用膠原酶Ⅰ型用消化分離得到臍靜脈內(nèi)皮原代細(xì)胞。膠原酶是最理想的血管內(nèi)皮細(xì)胞分離酶，對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，能使上皮細(xì)胞與膠原組織成功分離，且不損傷內(nèi)皮細(xì)胞，分離出的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量多，雜細(xì)胞污染少，且細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。

　　二、細(xì)胞復(fù)蘇

　　從液氮中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴中解凍至管內(nèi)殘留一點(diǎn)冰屑。用75%酒精擦拭凍存管后，將內(nèi)容物吸至一15ml無(wú)菌離心管中，逐滴加入預(yù)溫至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混勻，室溫1500rpm離心10分鐘棄上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗滌一次，離心后棄上清，加HUVEC完全培養(yǎng)液4－5ml備用，每支HUVEC凍存管含細(xì)胞量為5×105個(gè)。

　　三、細(xì)胞凍存

　　調(diào)整細(xì)胞數(shù)2-5×10個(gè)/ml，按含細(xì)胞的RPMI-1640液ml數(shù)，配制等量的凍存液。凍存液中FBS占80%，DMSO占20%。例：含細(xì)胞的RPMI-1640液為8ml，應(yīng)配凍存液8ml，其中FBS為6.4ml,DMSO為1.6ml，混勻。置細(xì)胞懸液于冰浴中，逐滴加入凍存液，邊加邊搖動(dòng)。加完后用吸管吹打混勻。于冰浴中分裝細(xì)胞于凍存管中，1.8ml/管，再將凍存管置于凍存盒內(nèi)置-80℃冰箱，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中保存。

　　四、應(yīng)用

　　用于RAS-線粒體依賴的自噬對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究：

　　腎素-血管緊張素（RAS）是最常見(jiàn)及最重要的心臟疾病致病因子。但在血管病變中RAS的活化狀態(tài)尚存爭(zhēng)議,而對(duì)不伴心肌病變的糖尿病患者是否需要應(yīng)用RAS抑制劑目前更是缺乏直接的理論依據(jù)。臨床試驗(yàn)則證實(shí)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑具有不同程度的血管內(nèi)皮保護(hù)作用,提示RAS可能參與內(nèi)皮功能損傷的進(jìn)程。但RAS在體內(nèi)的確切致病機(jī)制目前尚不清楚,近期的研究發(fā)現(xiàn),在心肌肥厚和心衰小鼠中,線粒體氧化應(yīng)激是RAS的一個(gè)值得信賴的靶點(diǎn)。

　　以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、糖尿病大鼠及無(wú)心血管、腫瘤并發(fā)癥的糖尿病患者為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,從組織、細(xì)胞及分子水平研究RAS-線粒體對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、衰老及自噬的影響及作用機(jī)制,并對(duì)可能的調(diào)控因子進(jìn)行探討。

　　研究主要探討不同葡萄糖濃度或者高葡萄糖濃度下不同作用時(shí)間對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬及凋亡的影響。

　　方法：

　　1、HUVEC在無(wú)血清ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后,加入不同濃度葡萄糖（11,16.5,22,27.5,33mM）共同作用72h,或者33mmM葡萄糖分別作用72,48,24,6h。ECM培養(yǎng)基基礎(chǔ)葡萄糖濃度5.5mM。同時(shí)給予33mM甘露醇作為對(duì)照排除滲透壓升高的影響。

　　2、葡萄糖處理后,分別行細(xì)胞周期、β-半乳糖苷酶染色、細(xì)胞衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集（SAHF）和衰老相關(guān)蛋白檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞衰老。

　　3、葡萄糖處理后,檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白及自噬啟動(dòng)蛋白的表達(dá),并分別給予AICAR、CC調(diào)控自噬啟動(dòng)蛋白AMPK,評(píng)估葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響。

　　4、葡萄糖處理后,流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。

　　結(jié)果：

　　1、葡萄糖呈現(xiàn)濃度及劑量依賴性地促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老,且這種促進(jìn)與滲透壓改變無(wú)關(guān)。

　　2、葡萄糖誘導(dǎo)自噬標(biāo)志蛋白及自噬啟動(dòng)蛋白的高表達(dá),且獨(dú)立于滲透壓改變。抑制AMPK磷酸化反應(yīng)可以廢除高糖誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。

　　3、培養(yǎng)條件下,高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。

　　結(jié)論：本研究表明,高糖可以明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬,但對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。且內(nèi)皮細(xì)胞損傷為滲透壓非依賴性。