胰蛋白酶的發(fā)現(xiàn)、特點(diǎn)和應(yīng)用及重組胰蛋白酶的發(fā)展歷程

1876年，德國科學(xué)家威廉• 屈內(nèi)（Wilhelm FriedrichKühne，1837~1900）在克勞德•伯爾納的基礎(chǔ)上，從“胰液”中分離提取出一種能降解其他生物物質(zhì)的物質(zhì)，它能降解其他的生物物質(zhì)，這也是胰蛋白酶的第一次分離。他還發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶最初是以胰蛋白酶原這一無活性的形式存在，經(jīng)過轉(zhuǎn)化成為活性胰蛋白酶。胰蛋白酶的發(fā)現(xiàn)使屈內(nèi)成為第一位發(fā)現(xiàn)降解蛋白質(zhì)的酶（即胰蛋白酶）的科學(xué)家，并且于1878年首次提出了酶（Enzyme）的概念。

圖1 胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶

胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶類，能特異性地作用于肽鏈Lys或Arg殘基的羧基端[1]。在生理上參與了動(dòng)物體內(nèi)的新陳代謝、消化、凝血等功能的重要過程[2]。在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，胰蛋白酶能使細(xì)胞膜與培養(yǎng)皿結(jié)合處蛋白降解，使得兩者分離。并且由于細(xì)胞自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力的作用下成為球形，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的消化。

其前體是沒有活性的胰蛋白酶原，從胰腺分泌之后在小腸中被腸激酶或胰蛋白酶激活[3]。不過尷尬的是，胰蛋白酶本身也是蛋白質(zhì)，所以厲害起來連自己都切，由原先的β-胰蛋白酶轉(zhuǎn)化為α-胰蛋白酶，進(jìn)一步降解為擬胰蛋白酶乃至碎片，活力也逐步下降而喪失。因此胰酶在制劑和活性、穩(wěn)定性的平衡上，面臨一些問題。

目前市面上的胰蛋白酶產(chǎn)品主要有凍干粉和液體兩個(gè)形式。未改造的胰蛋白酶一般通過凍干的形式儲(chǔ)存，復(fù)溶后使用，這樣保證了酶的活性，使用中，Ca2+有保護(hù)和激活作用。為了滿足液體制劑的需求，胰蛋白酶通常也會(huì)經(jīng)過特殊處理消除乳糜蛋白酶活性和甲基化或者突變以防止自切。

這是重組胰蛋白酶的時(shí)代
 

早期的胰蛋白酶在生物制藥的主要應(yīng)用是胰島素的生產(chǎn)，但很快也在其他領(lǐng)域發(fā)光發(fā)熱。但是它的“出生”地——豬、牛、羊胰臟，給他帶來了很多使用限制。動(dòng)物來源的胰蛋白酶雖然來源廣、價(jià)格低的，但這種動(dòng)物來源的胰蛋白酶一直被生物界質(zhì)疑，其安全性有一個(gè)致命缺點(diǎn)——攜帶大量可感染人的病毒，至少有67種之多[4]！因此，現(xiàn)代生物制藥生產(chǎn)中動(dòng)物源性原料使用具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，一些人畜共患病毒都有可能被帶入終產(chǎn)品中。如牛的BSE/TSE病毒，豬的口蹄疫病毒，人和動(dòng)物之間傳播的禽流感病毒等等。因此，動(dòng)物來源胰蛋白酶產(chǎn)品受到嚴(yán)格的質(zhì)量控制，但遺憾的是風(fēng)險(xiǎn)一直都在。

20世紀(jì)60年代曾在脊灰疫苗中曾檢測到SV40病毒，在黃熱減毒活疫苗中發(fā)現(xiàn)禽白血病病毒。2010年，又在輪狀病毒疫苗中也先后檢測到豬圓環(huán)病毒核酸（PCV）序列（Merck,GSK），當(dāng)時(shí)推測“元兇”可能是增殖中所用的豬胰蛋白酶。

GMP生產(chǎn)規(guī)則和減少動(dòng)物源性原輔料的使用，大大降低了外源因子污染的概率。政策層面，2019年9月國家藥監(jiān)局發(fā)布了《疫苗上市后生產(chǎn)工藝變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（征求意見稿）：“生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能避免使用人源或動(dòng)物源性原材料”，疫苗生產(chǎn)原輔料變更，將動(dòng)物源性的牛血清或胰酶變更為無動(dòng)物源的原輔料，只需要通過簡化變更流程，鼓勵(lì)企業(yè)進(jìn)行無動(dòng)物源原輔料的變更。

美國2015年頒布重組胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)，之后國外重組胰蛋白酶的應(yīng)用開始增加。2020年版《中國藥典》也增加了重組胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)[5]，將加快我國非動(dòng)物源性生物藥物的研發(fā)。

1974年，胰蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)被解析，并被歸類為絲氨酸蛋白酶家族。20世紀(jì)80年代末90年代初，通過定點(diǎn)突變和重組胰蛋白酶，研究了胰蛋白酶特殊氨基酸位點(diǎn)的功能。此后重組胰蛋白酶生產(chǎn)開始出現(xiàn)，利用基因重組技術(shù)在重組大腸桿菌中生產(chǎn)胰蛋白酶，可以完美避開動(dòng)物病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。重組胰蛋白酶從根源上對(duì)動(dòng)物源胰蛋白酶進(jìn)行了降維打擊，我們也會(huì)在下一篇的文章中詳細(xì)給大家講講胰蛋白酶的動(dòng)物源與非動(dòng)物源的差別。
 

當(dāng)前，重組胰蛋白酶已逐漸成為更高標(biāo)準(zhǔn)、更高要求的生物制藥首選。此外，部分疫苗批簽發(fā)還增加胰酶殘留檢測項(xiàng)目。如此以來，企業(yè)勢必也會(huì)傾向于使用安全性更加的重組胰蛋白，AOF生物藥物的發(fā)展方向。

上海逐典自研的Trypelectase

非動(dòng)物來源的重組胰蛋白酶
 

隨著新頒布的2020年版《中國藥典》首次增加了重組胰蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)在生物制藥生產(chǎn)使用安全性更高的重組胰酶已然是未來的趨勢。

為此上海逐典推出了專為疫苗、病毒載體生產(chǎn)設(shè)計(jì)的Trypelectase重組胰蛋白酶，聚焦于提供高效、非動(dòng)物源和高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品。
 

該胰蛋白酶氨基酸序列與豬/牛胰腺來源的胰蛋白酶一致，由大腸桿菌 （E.coli）重組表達(dá)生產(chǎn)。非動(dòng)物源、GMP級(jí)別、藥典標(biāo)準(zhǔn)的Trypelectase重組胰蛋白酶真正做到在傳統(tǒng)動(dòng)物源胰蛋白酶基礎(chǔ)上的更新?lián)Q代！
 

• 符合藥典中重組胰蛋白酶的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

• 生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境符合相關(guān)法規(guī)要求，生產(chǎn)過程完全符合GMP指導(dǎo)原則

• 重組生產(chǎn)，生產(chǎn)過程部使用任何動(dòng)物來源原料，無外源性病毒污染，使用安全

• 批量生產(chǎn)，可以保證穩(wěn)定連續(xù)的批次生產(chǎn)，產(chǎn)品批次間無差異，質(zhì)量穩(wěn)定

• 純度高，不含雜酶，宿主蛋白和宿主細(xì)胞DNA殘留量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)

[1]lsen JV, Ong SE & Mann M. Trypsin cleaves exclusively C-terminalto arginine and lysine residues [J], Mol Cel Proteomics, 2004,3(6):608-614.

[2]Lopes AR, Juliano MA, Juliano L, et al. Coevolution of insecttrypsins and inhibitors [J], Arch Insect Biochem Physiol, 2004,55(3):140-152.

[3]Berdutina A V., Neklyudov A D., Ivankin A I, et al.. Comparison ofproteolytic activities of the enzyme complex from mammalian pancreasand pancreatin[J].Applied Biochemistry and Microbiology, 2000, 36(4):363-367.

[4]Marcus-Sekura C，RichardsonJC，HarstonRK，etal. Evaluation of the human host range of bovine and porcine virusesthat may contaminate bovine serum and porcine trypsin used in themanufacture of biological products［J］.Biologicals，2011，39（6）：359-369.

[5]《中國藥典》2020年版,<3603> 重組胰蛋白酶