ibidi µ-Patterns 上細(xì)胞粘附的實(shí)驗(yàn)參數(shù)和優(yōu)化操作講解

本應(yīng)用說明討論了對(duì)于細(xì)胞粘附到 ibidi µ-Patterns 的重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)。此外，它還解釋了如何優(yōu)化細(xì)胞粘附和模式覆蓋。

關(guān)鍵詞

· µ-Patterning、粘附、結(jié)合基序、單細(xì)胞模式、多細(xì)胞微模式、細(xì)胞培養(yǎng)、粘附細(xì)胞

細(xì)胞類型

ibidi µ-Patterning 的成功實(shí)驗(yàn)僅限于貼壁細(xì)胞類型——懸浮細(xì)胞不能附著在圖案表面。此外，對(duì) µ-Pattern 表面的粘附高度依賴于細(xì)胞類型，因?yàn)椴⒎撬�有�?xì)胞類型都與所有結(jié)合基序結(jié)合。因此，在開始實(shí)驗(yàn)之前，有必要測試所選細(xì)胞類型是否能夠粘附在圖案表面上。

 

結(jié)合基序

ibidi µ-Patterning 技術(shù)為細(xì)胞粘附提供共價(jià)結(jié)合的結(jié)合基序。這些結(jié)合基序的表面密度可能不同于經(jīng)典的蛋白質(zhì)涂層。因此，結(jié)合基序可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)或粘附行為的改變。測試您的細(xì)胞是否與結(jié)合基序兼容的最佳方法是將它們接種在具有大粘合面積的圖案點(diǎn)上（例如，多細(xì)胞圖案）。驗(yàn)證單元格兼容性后，您可以切換到更小的模式，例如單單元格模式。

 

幾何圖案

由于結(jié)合基序的數(shù)量，圖案幾何形狀會(huì)影響細(xì)胞的粘附行為。例如，較小的形狀呈現(xiàn)較少的結(jié)合基序，與較大的形狀相比，這可能會(huì)降低細(xì)胞粘附。特別是對(duì)于單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，需要在圖案上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞占有率，圖案尺寸非常重要，因?yàn)樘�小的圖案阻礙了適當(dāng)?shù)募?xì)胞粘附和擴(kuò)散，而太大的圖案會(huì)導(dǎo)致多個(gè)細(xì)胞粘附在一個(gè)單點(diǎn)。此外，當(dāng)所用細(xì)胞類型的間距太小時(shí)，粘附斑塊之間的間距會(huì)影響理想的細(xì)胞接種濃度和細(xì)胞從一個(gè)點(diǎn)到另一個(gè)點(diǎn)的橋接。

細(xì)胞接種濃度

接種濃度是優(yōu)化粘附過程的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。較低的濃度會(huì)導(dǎo)致圖案上的細(xì)胞較少，或者只有稀疏占據(jù)的斑點(diǎn)，但結(jié)塊較少。較高的細(xì)胞濃度可以提高細(xì)胞覆蓋率，但要承擔(dān) a) 結(jié)塊和 b) 在單細(xì)胞粘附位點(diǎn)上出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。如果細(xì)胞濃度太高并且細(xì)胞在附著到粘附點(diǎn)之前開始聚集，這些漂浮的聚集體可能會(huì)從模式中分離粘附細(xì)胞并阻止進(jìn)一步的細(xì)胞粘附。

 

細(xì)胞懸液質(zhì)量

細(xì)胞懸液的均勻性高度影響實(shí)驗(yàn)輸出。沒有任何細(xì)胞聚集體的單細(xì)胞懸浮液非常適合單細(xì)胞檢測。接種細(xì)胞簇或球體懸浮液是 3D多細(xì)胞檢測的一種選擇。

 

培養(yǎng)時(shí)間

接種細(xì)胞后的孵育時(shí)間會(huì)影響粘附過程。與其他表面相比，細(xì)胞附著在圖案上所需的時(shí)間可能不同。在粘合過程中移動(dòng) µ-Patterned 載玻片時(shí)要特別小心。未連接或僅松散連接的細(xì)胞可能會(huì)開始結(jié)塊。

 

機(jī)械應(yīng)力和洗滌

部分附著的細(xì)胞可能會(huì)被機(jī)械力沖走。利用這種效果有助于去除細(xì)胞或碎片。根據(jù)洗滌步驟的強(qiáng)度（剪切應(yīng)力），可能會(huì)從表面洗掉更多或更少的細(xì)胞。

 

細(xì)胞適合度

細(xì)胞的活力和適應(yīng)性是適當(dāng)細(xì)胞粘附的重要因素。因此，請(qǐng)確保優(yōu)化細(xì)胞制備過程，以最大限度地減少細(xì)胞壓力。優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化影響細(xì)胞健康的因素，例如化學(xué)分離、溫度、機(jī)械應(yīng)力、懸浮時(shí)間、培養(yǎng)基成分和其他細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。

優(yōu)化 µ-Pattern 上的細(xì)胞粘附

 

 

初步測試：細(xì)胞類型是否與 µ-Pattern 兼容？

 

如果您不知道您的細(xì)胞類型是否與 µ-Patterning 的結(jié)合基序兼容，我們建議首先在多細(xì)胞 µ-Pattern 上運(yùn)行初始細(xì)胞粘附測試。在較大圖案上測試粘附減少了對(duì)結(jié)合基序本身的初始兼容性測試，同時(shí)排除了單細(xì)胞和圖案幾何效應(yīng)。

· 按照說明中的協(xié)議使用 2-3 種不同的細(xì)胞接種濃度，并通過將它們孵育至少 4 小時(shí)直至過夜，讓細(xì)胞不受干擾地粘附。

· 在洗掉未附著的細(xì)胞之前, 用相差顯微鏡控制細(xì)胞附著。拍攝細(xì)胞圖像總是有助于隨后優(yōu)化過程。

· 洗滌后至少 2 小時(shí)拍攝額外的圖像，讓細(xì)胞有時(shí)間從洗滌時(shí)經(jīng)歷的剪切應(yīng)力中恢復(fù)。

請(qǐng)注意：在此階段，不需要最佳模式覆蓋。任何細(xì)胞都堅(jiān)持該模式是很重要的。如果是這種情況，您可以繼續(xù)優(yōu)化所需模式的播種參數(shù)。如果您在孵育過夜后仍未在圖案上看到任何細(xì)胞附著，則您的細(xì)胞類型可能與所使用的結(jié)合基序不兼容。

優(yōu)化附著在 µ-Pattern 上的細(xì)胞的播種參數(shù)

 

如果您知道細(xì)胞與 µ-Pattern 的結(jié)合基序結(jié)合，則可以開始優(yōu)化所需模式上的細(xì)胞接種參數(shù)。請(qǐng)考慮每個(gè)模式都需要針對(duì)您的特定細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，因?yàn)槟Ｊ酱笮『湍Ｊ街�間的距離在很大程度上影響播種參數(shù)。確保細(xì)胞至關(guān)重要，并且您有單細(xì)胞懸液。

 

第一次優(yōu)化運(yùn)行

· 按照說明在載玻片上接種至少三種不同濃度的細(xì)胞。

· 讓細(xì)胞在洗滌前無干擾地粘附至少 4 小時(shí)。

· 在洗滌前和洗滌后至少 2 小時(shí)拍攝細(xì)胞圖像。

 

可能的結(jié)果和故障排除

 

– 洗滌后，細(xì)胞很好地固定在圖案上，圖案覆蓋度很好。

您已經(jīng)為您的實(shí)驗(yàn)找到了合適的播種參數(shù)。您可以使用相同的條件開始您的實(shí)驗(yàn)。

 

– 洗滌前，只有少數(shù)細(xì)胞漂浮和聚集。洗滌后，圖案上的細(xì)胞很少，圖案覆蓋率差。

細(xì)胞密度可能太低。在洗去未附著的細(xì)胞之前，嘗試更高的接種濃度并考慮更長的孵育時(shí)間。

 

– 在洗滌之前，有很多漂浮的、聚集的細(xì)胞。洗滌后，圖案上的細(xì)胞很少，圖案覆蓋率差。

細(xì)胞密度可能太高。嘗試降低初始接種濃度，因?yàn)檫^高的細(xì)胞密度通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集，阻礙細(xì)胞與模式結(jié)合。此外，在播種后 2 小時(shí)和 3 小時(shí)檢查細(xì)胞，看看更短的孵化時(shí)間是否會(huì)導(dǎo)致更少的聚集，從而更好地覆蓋模式。

 

– 洗滌后，圖案上會(huì)出現(xiàn)不需要的細(xì)胞聚集。

這表明初始接種濃度太高/或洗滌前孵育時(shí)間太長。嘗試較低的接種濃度，并在 2 小時(shí)和 3 小時(shí)后檢查細(xì)胞，看看較短的孵育時(shí)間是否足以使細(xì)胞粘附良好。

 

– 當(dāng)使用小的單細(xì)胞斑點(diǎn)或細(xì)線時(shí)，圖案上沒有細(xì)胞粘附或細(xì)胞呈圓形且不會(huì)擴(kuò)散。

如果您從之前的實(shí)驗(yàn)中知道細(xì)胞可以與所使用的圖案結(jié)合基序結(jié)合，則圖案尺寸對(duì)于您的細(xì)胞類型來說可能太小，并且細(xì)胞沒有足夠的空間來正確傳播和粘附。因此，為您的實(shí)驗(yàn)使用更大的圖案尺寸。

 

第二次優(yōu)化運(yùn)行

· 如上所述，根據(jù)第一次優(yōu)化運(yùn)行的結(jié)果使用優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。

將您的結(jié)果與第一次優(yōu)化運(yùn)行進(jìn)行比較，如有必要，進(jìn)入另一輪優(yōu)化。

示例圖像

圖1，L929 細(xì)胞不同接種濃度對(duì)單個(gè)細(xì)胞模式的影響。(A) 將細(xì)胞以 1*10 5cells/ml加入µ-Slide VI 0.4，(B) 3*10 5 cells/ml、(C) ) 5.25*105 cells/ml。24 小時(shí)后，洗去未附著的細(xì)胞，并在洗滌后 2 小時(shí)拍攝圖像。在低接種密度下，許多點(diǎn)沒有被任何細(xì)胞覆蓋。然而，在太高的接種濃度下，細(xì)胞開始在圖案上聚集。

 

 

圖 2：不同圖案孔大小對(duì) Rat1 細(xì)胞在單個(gè)細(xì)胞圖案上的傳播行為的影響。將細(xì)胞接種到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 為 (A) 20 µm 正方形，距離為 110 µm 或 (B) 30 µm 正方形，距離為 110 µm，濃度為 9*105 cells/ml。24 小時(shí)后，洗去未附著的細(xì)胞，并在洗滌后 2 小時(shí)拍攝圖像。對(duì)于 Rat1 細(xì)胞，20 µm 正方形對(duì)于良好的細(xì)胞擴(kuò)散來說太小了，而 30 µm 正方形為細(xì)胞提供了足夠的區(qū)域以在圖案上展平。

 

圖 3：不同圖案幾何形狀對(duì) NIH3T3 細(xì)胞在單個(gè)細(xì)胞圖案上的擴(kuò)散行為的影響。將細(xì)胞接種到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 為 (A) 20 µm 正方形，距離為 110 µm，或 (B) 30 µm 正方形，距離為 110 µm，濃度為 3* 10 5 cells/ml。24 小時(shí)后，洗去未附著的細(xì)胞，并在洗滌后 2 小時(shí)拍攝圖像。對(duì)于 NIH3T3 細(xì)胞，20 µm 正方形對(duì)于良好的細(xì)胞擴(kuò)散來說太小了，而 30 µm 正方形為細(xì)胞提供了足夠的區(qū)域以使其在圖案上變平。然而，由于圖案邊緣之間的距離小了 10 µm，細(xì)胞能夠從一個(gè)點(diǎn)連接到另一個(gè)點(diǎn)。對(duì)于該細(xì)胞系，需要更大的圖案之間的距離。

 

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