現(xiàn)行細(xì)胞計數(shù)方法存在的問題與解決辦法

1. 細(xì)胞計數(shù)的意義
計數(shù)細(xì)胞是了解細(xì)胞數(shù)量變化的基本方法，細(xì)胞數(shù)量變化是細(xì)胞生理功能表現(xiàn)的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量變化提供準(zhǔn)確的功能信息，錯誤的細(xì)胞數(shù)量變化提供錯誤的功能信息。所以細(xì)胞計數(shù)準(zhǔn)確性決定細(xì)胞生理學(xué)研究的成功與失敗。

2. 細(xì)胞計數(shù)要解決的問題
細(xì)胞計數(shù)的目的是確定細(xì)胞樣本中的細(xì)胞數(shù)量，一般是指單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，如1升血樣本中含有多少個紅細(xì)胞，多少個白細(xì)胞；細(xì)胞學(xué)實驗經(jīng)常需要比較細(xì)胞處理前后的數(shù)量變化。計數(shù)細(xì)胞就是確定細(xì)胞樣本處理前后每單位樣本中含有多少個細(xì)胞，即單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

3. 現(xiàn)行細(xì)胞計數(shù)儀器和計數(shù)方法存在的問題
 現(xiàn)在計數(shù)細(xì)胞的儀器和方法不少，但計數(shù)準(zhǔn)確度都不高，達(dá)不到細(xì)胞學(xué)研究要求的水平。原因出在細(xì)胞計數(shù)儀設(shè)計師對細(xì)胞計數(shù)的目的要求和細(xì)胞計數(shù)操作過程，認(rèn)識不夠清楚，設(shè)計的儀器結(jié)構(gòu)原理有問題。以細(xì)胞計數(shù)板為例，細(xì)胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)不太合理。細(xì)胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)是在一片玻璃板上蝕刻出一個細(xì)胞計數(shù)池，呈方形，邊長1mm,深度0.1mm，容積是0.1mm³=0.1微升=萬分之一毫升，底面用線分割成方格。計數(shù)板計數(shù)的細(xì)胞數(shù)準(zhǔn)確度沒有問題，刻蝕的容積也沒有問題，問題出在使用方法。細(xì)胞計數(shù)的時候，計數(shù)池上面加了一個蓋玻片，細(xì)胞樣本是從計數(shù)板與蓋玻片之間的縫隙中加進(jìn)去的。細(xì)胞液充滿計數(shù)池和計數(shù)池與蓋玻片之間的空隙，這個空隙中的細(xì)胞也進(jìn)入計數(shù)池。因此計數(shù)的細(xì)胞體積應(yīng)該是計數(shù)池的體積加上空隙體積�？障扼w積是多大，不知道，計算細(xì)胞密度的時候都不計算內(nèi)，被忽略掉了，所以細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)的細(xì)胞密度不準(zhǔn)確。縫隙體積很小，但相對于只有0.1微升的計數(shù)池體積，影響是很大的，可能達(dá)到15%或更大，所以是不可以忽略掉的。計數(shù)池容積太小和加蓋玻片是細(xì)胞計數(shù)板的致命傷。

細(xì)胞計數(shù)板是最常用的細(xì)胞計數(shù)方法，優(yōu)點是簡單、方便，計數(shù)細(xì)胞真實，數(shù)量準(zhǔn)確。缺點是計量體積不準(zhǔn)確，計數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確，另外計數(shù)的細(xì)胞無法回收使用和細(xì)胞數(shù)量少于10萬的樣本無法計數(shù)也是問題。

細(xì)胞自動計數(shù)分析儀(Cellometer )是最近推出來的細(xì)胞計數(shù)方法。Cellometer的問題比較大。Cellometer是基于圖像分析的細(xì)胞計數(shù)儀。計數(shù)原理類似與血球計數(shù)板，只是用儀器攝像代替人眼觀察細(xì)胞計數(shù)。加20ml樣本到計數(shù)儀計數(shù)板的樣品室內(nèi)，使細(xì)胞平鋪為單層細(xì)胞，將計數(shù)板放入計數(shù)儀內(nèi)，通過儀器攝像頭選擇一個視野，記錄視野內(nèi)的細(xì)胞。該儀器的細(xì)胞計數(shù)方法沒有記錄樣品室內(nèi)的全部細(xì)胞，只是選取樣品室內(nèi)細(xì)胞分布的一個視野進(jìn)行計數(shù)。儀器設(shè)定的視野面積近似于血球計數(shù)板一個白細(xì)胞計數(shù)單位的面積，沒有考慮樣品深度，而且顯微鏡視野面積受放大倍數(shù)影響，面積和深度都不確定，體積更是問題，體積不準(zhǔn)確，計數(shù)出來的細(xì)胞濃度不會準(zhǔn)確。因此Cellometer細(xì)胞計數(shù)方法可信度很低。

流式細(xì)胞計數(shù)儀，以B.Dtc20-automated-cell-counter 為例，是臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用比較多的細(xì)胞計數(shù)方法。這是一種基于庫爾特原理的細(xì)胞計數(shù)儀。庫爾特原理認(rèn)為，懸浮在電解液中的顆粒隨電解液通過小孔管時，取代相同體積電解液，導(dǎo)致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化，產(chǎn)生電位脈沖，脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。這類細(xì)胞計數(shù)儀是根據(jù)細(xì)胞通過小孔引起電位變化計算細(xì)胞個數(shù)。儀器根據(jù)細(xì)胞體積大小設(shè)定脈沖信號上下限，在上下限之間的顆粒信號作為細(xì)胞記錄，大于上限和小于下限的顆粒信號不作為細(xì)胞記錄，與顆粒的顏色、形狀、性質(zhì)無關(guān)。這種計數(shù)方法不能區(qū)分細(xì)胞與非細(xì)胞顆粒，體積與細(xì)胞大小相同的非細(xì)胞顆粒也作為細(xì)胞記錄下來，非細(xì)胞顆粒造成假陽性細(xì)胞，大于和小于設(shè)定孔徑的細(xì)胞不作細(xì)胞計數(shù)造成假陰性。這類細(xì)胞計數(shù)儀的優(yōu)點是，自動化程度高，快速方便，樣本體積計量準(zhǔn)確；主要問題是存在假陽性和假陰性問題，誤差比較大，計數(shù)的細(xì)胞密度準(zhǔn)確度或真實性不高，而且檢測的細(xì)胞數(shù)量不能太少，細(xì)胞不能回收使用。該方法用于臨床檢驗（要求準(zhǔn)確度不高）還可以，但不適合細(xì)胞學(xué)實驗。

4. 細(xì)胞計數(shù)問題的解決辦法
上面介紹的三種類型細(xì)胞計數(shù)方法，涵蓋了現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域細(xì)胞計數(shù)的基本技術(shù)和方法。細(xì)胞計數(shù)是要獲得一個準(zhǔn)確的細(xì)胞密度。細(xì)胞密度是單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。計數(shù)細(xì)胞樣本的體積準(zhǔn)確，細(xì)胞數(shù)準(zhǔn)確，密度才會準(zhǔn)確。三種細(xì)胞計數(shù)方法，要么計數(shù)樣本體積不準(zhǔn)確（血球計數(shù)板，自動細(xì)胞計數(shù)儀），要么細(xì)胞計數(shù)不準(zhǔn)確（流式細(xì)胞儀），所以細(xì)胞計數(shù)結(jié)果都不夠準(zhǔn)確。

計數(shù)細(xì)胞獲得一個準(zhǔn)確的細(xì)胞密度，看起來很復(fù)雜，難度很大，實際上真正理解了細(xì)胞計數(shù)的目的和要求，問題不難解決。如果能夠準(zhǔn)確取一定容量細(xì)胞樣本，放到一個容器里，準(zhǔn)確記錄全部細(xì)胞，問題就解決了。怎樣準(zhǔn)確記錄一個容器里的全部細(xì)胞？如果容器里有幾百個細(xì)胞，無規(guī)律分布在底面上，用顯微鏡觀察，全部準(zhǔn)確計數(shù)出來不太可能，如果把容器底部分割成許多個方格，標(biāo)出行列號，一個方格中只有幾個細(xì)胞（不超過10個），很容易準(zhǔn)確記錄出來，既不會漏計，也不會重計，將各個方格里的細(xì)胞數(shù)匯總起來就是全部細(xì)胞數(shù)。具體辦法是改變計數(shù)板的結(jié)構(gòu)，加大計數(shù)池容積，設(shè)計一個底面積4.0mm´4.0mm,高度10.0mm,總體積是160微升的方形計數(shù)杯，底面上刻蝕16´16條線，標(biāo)上行列號，構(gòu)成256個方格。杯口稍大一些6.0mm´6.0mm，單個計數(shù)杯不好放置，最好8個一組并列成條狀，再給條型杯配置一個蓋子和一個架子。條形細(xì)胞計數(shù)杯用塑料做成一次性的，能夠滅菌處理，方便回收細(xì)胞。這樣的細(xì)胞計數(shù)杯，計數(shù)準(zhǔn)確，造價低廉，使用方便。

如果做成方形杯有困難，可用一個簡單辦法替代，直接在96孔細(xì)胞培養(yǎng)（檢測）板的底面上刻蝕16´16條線也可以。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板有條形的。

計數(shù)的時候，只需取一定量細(xì)胞液，如10.0微升，加入計數(shù)池或計數(shù)孔中，加蓋（不會與液面接觸）。這樣的計數(shù)板不能用正置顯微鏡計數(shù)，需要用倒置顯微鏡。

5. 新型細(xì)胞計數(shù)板的特點和適用對象
新型細(xì)胞計數(shù)板是一個底面上標(biāo)記有方格的細(xì)胞培養(yǎng)板或檢測板。操作簡便，只需將一定量細(xì)胞液放入計數(shù)孔內(nèi)，直接在顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)值除以體積乘上稀釋倍數(shù)就是細(xì)胞濃度。計數(shù)板造價低廉，無菌處理，一次性使用。計數(shù)的細(xì)胞可以回收，再用于實驗。

新型細(xì)胞計數(shù)板的優(yōu)勢是計數(shù)的細(xì)胞濃度準(zhǔn)確度高，計數(shù)的細(xì)胞可以回收使用。其他細(xì)胞計數(shù)儀器能解決的問題，它也能解決，但是它能解決的有些問題其他細(xì)胞計數(shù)儀器解決不了，如準(zhǔn)確計數(shù)幾百個細(xì)胞，回收再用于實驗，上述三種細(xì)胞計數(shù)儀器都做不到。新型計數(shù)板適合細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)實驗研究使用，是的主要應(yīng)用對象，臨床檢驗細(xì)胞計數(shù)也可以應(yīng)用。臨床檢驗要求細(xì)胞計數(shù)簡單快捷，能夠處理大批量樣本，不要求細(xì)胞計數(shù)非常準(zhǔn)確，新型計數(shù)板可以做血細(xì)胞常規(guī)項目檢驗，但與流式細(xì)胞儀比較不具有優(yōu)勢。

新型細(xì)胞計數(shù)板輔助設(shè)備只需要一臺顯微鏡，使用簡單方便。既可以用于細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)研究，也可以用于臨床檢驗。研究單位，臨床單位，教學(xué)單位，都可以應(yīng)用，個體診所也買得起用得上。細(xì)胞準(zhǔn)確計數(shù)的問題國內(nèi)外都沒有解決，國內(nèi)有需求，國外也有需求，所以應(yīng)用市場非常廣闊。新型細(xì)胞計數(shù)板結(jié)構(gòu)簡單，很容易設(shè)計制造，誰先制造出來，誰就占有了市場，后來者很難再有機會。