基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中的應用
小分子藥物研發(fā)現(xiàn)狀
藥物研發(fā)是一個跨學科整合板塊，隨著各學科基礎研究和科學技術(shù)的進步，對安全有效藥物的需求也日益增加。從2015年-2020年，F(xiàn)DA共批準了245款新藥物，其中小分子藥物有164種，占到62%。批準小分子藥物涵蓋了抗腫瘤、抗感染、神經(jīng)系統(tǒng)、自身免疫、代謝等范疇，是藥物研發(fā)重點方向[1]（1. U.S. FDA Approved Drugs from 2015-June 2020: A Perspective）。一個小分子藥物的發(fā)現(xiàn)需要化學、生物學、臨床醫(yī)學學科的精耕細作，從候選分子篩選到臨床上市，大約需要10年時間。藥物研發(fā)宗旨是安全有效，具有高投入、低產(chǎn)出特征，每年僅有屈指可數(shù)的藥物分子通過審批，從Phase I階段到批準上市成功率約為9.5%，尤其是抗腫瘤小分子靶向藥物成功率僅為5.1%，排名最靠后[2]，如圖1（Clinical Development Success Rates 2006-2015）。小分子藥物成功率低主要受限于以下因素：
（1）缺乏新靶點的發(fā)現(xiàn)；
（2）缺乏合理和針對性的臨床前評價體系和模型；
（3）易出現(xiàn)耐藥性。
圖1. 各類疾病藥物研發(fā)的成功率
近年來，小分子藥物發(fā)展更是受到了抗體藥物、基因療法、細胞療法、ADC藥物、溶瘤病毒的強勢競爭，因此急需解決以上技術(shù)難題，提高小分子藥物研發(fā)效率、成功率與競爭力。
基因編輯技術(shù)簡介與原理
基因編輯技術(shù)為經(jīng)典和常用的分子生物學技術(shù)，在藥物研發(fā)、基因治療、基礎研究、診斷技術(shù)開發(fā)等方面廣泛應用。對于小分子藥物研發(fā)，基因編輯可以通過基因敲入、基因敲除、堿基轉(zhuǎn)換、染色重排，順利解決上述臨床前評價體系、新靶點發(fā)現(xiàn)、耐藥性問題。
基因編輯技術(shù)的核心是通過程序化的人工核酸酶，定點對基因組DNA進行改造。到目前為止，總共有3款基因編輯技術(shù)實現(xiàn)了應用，第一代鋅指核酸酶 (zinc-finger nuclease, ZFN)技術(shù)、第二代轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(shù)、第三代CRISPR/Cas9 技術(shù)，在藥物研發(fā)、基因療法、細胞療法方面應用廣泛[3]（基因編輯技術(shù)的原理及其在癌癥研究中的應用），如圖2所示。
圖2. ZEN，TALEN，CRISPR基因編輯原理
三代基因編輯技術(shù)各有優(yōu)劣勢，ZFN技術(shù)易脫靶、效率低、時間周期長；TALEN技術(shù)通量小、難以做到多基因敲除，都極大的限制了技術(shù)的應用，而第三代技術(shù)兼?zhèn)渫�、技術(shù)壁壘降低、成本時間耗用少優(yōu)勢，得到大規(guī)模應用和推廣，更是獲得了2020年諾貝爾化學獎，本文將以第三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為例，詳細介紹其在小分子藥物研發(fā)中的應用，如表1所示。
表1. 三種基因編輯技術(shù)優(yōu)劣勢比較
基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中應用
CRISPR/Cas9本身為原核生物免疫系統(tǒng)抵御外來病原體的一部分，將其引入基因編輯領(lǐng)域，可以高效準確的進行目的基因缺失、插入、堿基替換等工作，豐富了生物科學家的技術(shù)手段。以小分子靶向藥物治療為主的肺癌、乳腺癌、血液瘤為例，該類疾病基因分型完善，標準臨床治療方案為結(jié)合分子病理分型選取相應小分子藥物加以治療，如EGFR T790M突變采用三代EGFR抑制劑奧西替尼，BRCA1/2同源重組修復缺陷變化采用PARP抑制劑，BCR-ABL融合使用伊馬替尼。
構(gòu)建點突變模型
基因編輯技術(shù)可以為這類型的小分子藥物研發(fā)提供臨床前篩選平臺。藥物研發(fā)，前期都需在特異性體內(nèi)外模型中進行候選分子篩選和驗證。傳統(tǒng)方法構(gòu)建篩選驗證平臺難以模擬發(fā)病機制，建模耗時長、成功率低，而基因編輯技術(shù)可以從基因組水平編輯目的基因，可高度模擬疾病機制和進展狀態(tài)，極大簡化了建模流程、縮短建模周期。目前常用的EGFR常見突變、罕見突變、外顯子插入細胞模型，都是根據(jù)基因編輯技術(shù)在細胞層面進行改造，如EGFR T790M、C797S、L858R、G719X、L861Q、S768I、20號外顯子插入（exon20ins）等。Mi-Young Park等人[4]（Generation of lung cancer cell lines harboring EGFR T790M mutation by CRISPR/Cas9-mediated genome editing）通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了PC9 T790M突變增強型細胞株，在PC9原有基礎上提高了T790M突變比例，并且在等量吉非替尼暴露下，PC9 T790M突變細胞株耐藥性更強，但對奧西替尼敏感性更強。因此利用CRISPR/Cas9構(gòu)建的點突變細胞株效率更高，更適用于三代EGFR小分子抑制劑篩選。
構(gòu)建基因融合模型
此外，基因編輯技術(shù)可進行染色體重排，為血液瘤提供疾病模型。許多血液瘤發(fā)病起源于染色體上基因重排或融合，如CML/AML（慢性粒細胞白血病/急性粒細胞白血病）與BCR-ABL基因融合相關(guān)，PDGRFα重排與CEL（慢性嗜酸性粒細胞白血病）相關(guān)，并且由于血液瘤發(fā)病進程長，疾病分子變化復雜，構(gòu)建難度和疾病模擬度都需要更加成熟的技術(shù)手段。Icahn Mount Sinai大學的研究者們[5]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以多能干細胞（iPS）為載體，將AML疾病相關(guān)基因ASXL1/SRSF2/NRAS按照順序編輯導入多能干細胞中，創(chuàng)建一個突變不斷增加的腫瘤疾病細胞模型，可模擬AML發(fā)病全程，從早期異常血象開始，到骨髓異常增生，到后期演變?yōu)锳ML，便于觀察各階段轉(zhuǎn)換機制。由此可見，基因編輯技術(shù)可為小分子藥物研發(fā)提供更貼合實際的細胞與動物模型。該類型例子更是在代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛應用。
圖3. 模擬AML疾病進程轉(zhuǎn)換
圖4. AML與CRISPR/Cas9實驗設計方案
發(fā)現(xiàn)新藥物靶點
CRISPR/Cas9技術(shù)可大規(guī)模篩選藥物靶點，發(fā)現(xiàn)新藥物靶點。目前人類基因組編碼的蛋白質(zhì)中，約75%的靶點被認為與疾病治療無關(guān)，而剩余25%的靶點中又有60%的靶點無法成藥。目前已知的約5000個疾病分子基礎中，只有250中疾病有治療方案，因此發(fā)現(xiàn)藥物新作用靶點對藥物研發(fā)至關(guān)重要。實驗人員[6]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向編碼蛋白功能性區(qū)域的外顯子序列，對小鼠急性髓系白血病細胞系中192個染色質(zhì)功能調(diào)節(jié)區(qū)域進行了篩選，證實了6個已在研的藥物靶點，19個潛在藥物作用新靶點，DOT1L, EZH2, EHMT1/2、KDM1A做為MLL-AF9白血病藥物靶點開發(fā)了相關(guān)抑制劑（Discovery of cancer drug targets by CRISPR/Cas9 screening of protein domains）。由此可見，利用基因編輯技術(shù)可發(fā)現(xiàn)全新藥物作用靶點，豐富小分子藥物產(chǎn)品管線。
圖5. CRISPR/Cas9靶向編碼蛋白外顯子序列原理
圖6. 差異基因篩選
協(xié)同致死研究
CRISPR/Cas9技術(shù)可作為協(xié)同致死研究手段，大規(guī)模驗證基因互做關(guān)系，為小分子藥物找到效應組合，達到擴增適應癥、增加臨床獲益目的。John Paul Shen等人[7]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯HeLa，A549和293T細胞系，通過測試兩個靶向基因?qū)毎L的影響判斷兩者間作用關(guān)系。研究者們共分析了73個基因，進行了141,912次交互作用分析，最后發(fā)現(xiàn)這73個癌基因之間的遺傳關(guān)系，存在著152對協(xié)同致死效應組合。包括BRCA1/2同源重組修復缺陷指導PARP抑制劑用藥，CCND1與CDK4/6抑制劑，PTEN與mTOR抑制劑。
圖7. CRISPR/Cas9篩選協(xié)同致死組合
基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中應用廣泛，涵蓋小分子藥物研發(fā)全流程。從候選分子篩選、藥理學研究、毒理研究到轉(zhuǎn)化醫(yī)學都可借助基因編輯。隨著技術(shù)發(fā)展，更是滲透到臨床診療。張力教授團隊在肺癌中發(fā)現(xiàn)新ALK融合位點，使用基因編輯技術(shù)驗證了新融合組合功能和對ALK抑制劑敏感性，最后輔助患者臨床用藥，并獲得較好臨床藥效。因此，伴隨醫(yī)學與生物學的完善，基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中應用將在基因敲入、敲除、堿基轉(zhuǎn)換基礎上向外拓展，獲得更多樣化發(fā)展。
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參考文獻：
[1] Bhutani, P., et al., U.S. FDA Approved Drugs from 2015–June 2020: A Perspective. Journal of Medicinal Chemistry, 2021. 64(5).
[2] Mullard, A., Parsing clinical success rates. Nature Reviews Drug Discovery, 2016. 15(7): p. 447.
[3] 謝一方, et al., 基因編輯技術(shù)的原理及其在癌癥研究中的應用. 中國腫瘤生物治療雜志, 2017. 08(v.24;No.119): p. 6-18.
[4] Park, M.Y., et al., Generation of lung cancer cell lines harboring EGFR T790M mutation by CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Oncotarget, 2017. 8(22).
[5] Wang, T., et al., Sequential CRISPR gene editing in human iPSCs charts the clonal evolution of leukemia. 2020.
[6] Junwei, et al., Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.
