實(shí)驗(yàn)手冊(cè)︱行為學(xué)成癮系列（一）

01.準(zhǔn)備

• Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorIncubation of Cocaine Craving After Intermittent-Access Self-administration: Sex Differences and Estrous Cycle
• Materials and Reagents（材料與試劑）實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組，自主給藥時(shí)給生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組，自主給藥時(shí)給受試藥物。
• Equipment （儀器設(shè)備）
  Lafayette斯金納箱-自主給藥系統(tǒng)

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02.Principle（原理）

自主給藥系統(tǒng)（自身給藥實(shí)驗(yàn)）是行為藥理研究的常用方法，它利用某些藥物的正性強(qiáng)化作用，通過一定條件控制，使動(dòng)物建立起行為與獎(jiǎng)賞之間的聯(lián)系，從而模擬人類藥物濫用的一些情況。

1954年，詹姆斯·奧爾茲和皮特·米爾納最先認(rèn)識(shí)到腦內(nèi)存在獎(jiǎng)賞系統(tǒng)并運(yùn)用動(dòng)物自主給藥系統(tǒng)：按壓按鈕使大鼠接受大腦中的對(duì)特定部位短暫的電刺激。

獎(jiǎng)賞環(huán)路的分類

正性獎(jiǎng)賞環(huán)路（增大獎(jiǎng)賞效應(yīng)）和負(fù)性獎(jiǎng)賞環(huán)路（抑制獎(jiǎng)賞效應(yīng)），此處主要介紹正反饋?zhàn)灾鹘o藥實(shí)驗(yàn)。

1、正性獎(jiǎng)賞環(huán)路

中腦邊緣多巴胺（Dopamine，DA）系統(tǒng)是獎(jiǎng)賞環(huán)路的中心。該系統(tǒng)主要起源于兩個(gè)腦區(qū)：中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）和黑質(zhì)致密部（Substantial nigra pars compacta，SNpc）。VTA多巴胺能神經(jīng)元主要投射到伏隔核（Nucleus Accumbens，NAcc）、內(nèi)側(cè)前額葉皮層（Medial Prefrontal Cortex）和基底外側(cè)杏仁核（basolateral nucleus of amygdale，）。此外，基底外側(cè)杏仁核的谷氨酸能神經(jīng)元可以通過 NAcc 間接投射到VTA。內(nèi)側(cè)前額葉皮層也能投射到VTA，這些腦區(qū)共同構(gòu)成了正性獎(jiǎng)賞環(huán)路。其中，VTA富含多巴胺能神經(jīng)元，是調(diào)控獎(jiǎng)賞功能的主要區(qū)域，這就是獎(jiǎng)勵(lì)對(duì)動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌的作用的體現(xiàn)之一。

2、負(fù)性獎(jiǎng)賞環(huán)路

研究表明LHb接收來自蒼白球、下丘腦和前扣帶回等腦區(qū)的輸入，然后投射到VTA的多巴胺能神經(jīng)元。這些通路共同構(gòu)成了負(fù)性獎(jiǎng)賞環(huán)路。外側(cè)韁核（lateral habenula，LHb）是負(fù)性獎(jiǎng)賞環(huán)路的主要區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，向猴子進(jìn)行厭惡刺激會(huì)強(qiáng)烈激活LHb神經(jīng)元；用光遺傳方法激活大鼠腳內(nèi)核到LHb的輸入會(huì)使得大鼠厭惡、逃避所探索的環(huán)境。這表明在嚙齒類動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中LHb均參與處理和編碼厭惡信息，提示我們可通過激活LHb來抑制獎(jiǎng)賞效應(yīng)，從而治療藥物成癮、抑制動(dòng)物刻板行為的目的。

03.Procedure （方法步驟）

適應(yīng)期

1. handle動(dòng)物3-7天，使動(dòng)物適應(yīng)被抓取，不會(huì)產(chǎn)生過大的應(yīng)激反應(yīng)

學(xué)習(xí)期

1. 斯金納箱預(yù)設(shè)程序，壓桿一次給予糖水獎(jiǎng)勵(lì)（比較簡(jiǎn)單，無需禁食），每個(gè)實(shí)驗(yàn)周期設(shè)為10分鐘或壓桿20次；
2. 將動(dòng)物放入斯金納箱進(jìn)行學(xué)習(xí)，每天1次；
3. 動(dòng)物10分鐘內(nèi)按壓壓桿20次，且按壓后進(jìn)入食槽獲得獎(jiǎng)勵(lì)概率大于85%，穩(wěn)定重復(fù)2天，視為學(xué)會(huì)壓桿；
4. 當(dāng)有滿足分組數(shù)量足夠多的動(dòng)物學(xué)會(huì)壓桿操作后（每組額外預(yù)留多只動(dòng)物，后續(xù)仍會(huì)有淘汰階段），結(jié)束學(xué)習(xí)期，淘汰沒有學(xué)會(huì)壓桿的動(dòng)物（淘汰動(dòng)物可以用于其它實(shí)驗(yàn)）。

實(shí)驗(yàn)期

1. 對(duì)所有學(xué)會(huì)壓桿的動(dòng)物進(jìn)行靜脈埋管；
2. 埋管后重復(fù)一天斯金納箱學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，剔除埋管導(dǎo)致壓桿行為喪失的動(dòng)物；
3. 將剩余動(dòng)物按照實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行分組；
4. 斯金納箱預(yù)設(shè)程序 ，壓桿一次給予藥物注射一定時(shí)間，藥物依據(jù)分組不同而不同。每個(gè)實(shí)驗(yàn)周期設(shè)為10分鐘；
5. 將動(dòng)物放入斯金納箱中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每天1次，共計(jì)2天。

04.檢測(cè)數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)期動(dòng)物按壓壓桿的次數(shù)。

正性獎(jiǎng)賞環(huán)路實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組一般注射溶劑或者生理鹽水等動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生成癮反應(yīng)的液體，動(dòng)物會(huì)在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)生行為消退，兩次實(shí)驗(yàn)過程中按壓壓桿次數(shù)會(huì)減少。若藥物對(duì)于動(dòng)物有成癮作用，則動(dòng)物會(huì)視藥物注射為獎(jiǎng)勵(lì)，壓桿操作則不會(huì)因?yàn)橄�退而�?dǎo)致減少，甚至可能會(huì)產(chǎn)生更多次的按壓行為。負(fù)性獎(jiǎng)賞環(huán)路實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組一般注射容易讓動(dòng)物產(chǎn)生成癮反應(yīng)的液體，從而動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過程中不易發(fā)生行為消退，兩次實(shí)驗(yàn)過程中壓桿次數(shù)不會(huì)減少，甚至?xí)�增多。若受試藥物�?duì)此有抑制作用，則動(dòng)物會(huì)發(fā)生行為消退，兩次實(shí)驗(yàn)過程中按壓壓桿次數(shù)會(huì)減少。

05.數(shù)據(jù)分析方法

*注意事項(xiàng)

1. 觸鼻和壓桿是兩種經(jīng)典斯金納箱常用響應(yīng)方式。之所以選擇壓桿而不是觸鼻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是因?yàn)橛|鼻是動(dòng)物本來就存在的一種行為，造模相對(duì)會(huì)比較類似于經(jīng)典條件反射。
2. 實(shí)驗(yàn)期應(yīng)對(duì)動(dòng)物食槽進(jìn)行遮擋，避免動(dòng)物進(jìn)入食槽時(shí)可能會(huì)扯掉給藥導(dǎo)管。
3. 如果需要同時(shí)評(píng)估藥物除了成癮外的其它功能，如對(duì)動(dòng)物記憶、注意力的作用等，則需使用更為復(fù)雜的斯金納箱應(yīng)用程序來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期也會(huì)有所延長(zhǎng)。若受試藥物為興奮劑類型的藥物，動(dòng)物可能會(huì)進(jìn)入過度亢奮的狀態(tài)，產(chǎn)生如四處亂跳等亢奮行為，會(huì)對(duì)壓桿操作有一定的影響。此時(shí)建議結(jié)合視頻錄制來觀察動(dòng)物狀態(tài)，確定藥物是否有成癮傾向

 

 

01.準(zhǔn)備

• Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorChemogenetic inhibition of lateral habenula projections to the dorsal raphe nucleus reduces passive coping and perseverative reward seeking in rats
• Materials and Reagents（材料與試劑）糖精、清潔水、千分秤
• Equipment （儀器設(shè)備）Lickometer舔舐行為測(cè)試系統(tǒng)

（點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情→）

02.Principle（原理）

糖水偏好測(cè)試是一項(xiàng)簡(jiǎn)單的任務(wù)，用于評(píng)估嚙齒動(dòng)物模型中的動(dòng)機(jī)、抑郁(和無快感)及相關(guān)情緒狀態(tài)，也用于更復(fù)雜的模型，如產(chǎn)后抑郁癥和停藥等。

1981年，Katz等人首次在抑郁大鼠造模過程中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后的大鼠蔗糖和糖精水的消耗減少達(dá)50%，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)三環(huán)類抗抑郁藥丙咪嗪可顯著增加模型組大鼠糖水的消耗量，隨后Willner等使用糖水偏好實(shí)驗(yàn)對(duì)CUMS（Chronic unpredictable mild stress，慢性輕度不可預(yù)見刺激應(yīng)激模型）大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)和應(yīng)激強(qiáng)度增加，模型大鼠的糖水消耗率明顯下降，且該結(jié)果可被抗抑郁藥物去甲丙咪嗪改善。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)排除了大鼠糖水消耗減少是出于熱量調(diào)節(jié)失調(diào)或應(yīng)激后血糖升髙引起糖水?dāng)z入量降低的猜想。此重要發(fā)現(xiàn)說明了內(nèi)源性抑郁癥的核心特征是獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制缺陷和快感缺乏。現(xiàn)代研究表明，作為中腦“獎(jiǎng)勵(lì)中心”的單胺核團(tuán)，多巴胺系統(tǒng)邊緣通路與獎(jiǎng)賞機(jī)制有關(guān)叫外側(cè)韁核則是大腦的“反獎(jiǎng)勵(lì)中樞”，其簇狀放電方式增強(qiáng)了對(duì)腹側(cè)被蓋區(qū)與中縫背核的抑制，進(jìn)而導(dǎo)致了快感缺失與行為絕望，是抑郁癥發(fā)生的充分條件。

03.Protocol （方法步驟）

1. Day1-3：適應(yīng)實(shí)驗(yàn)房間（單籠飼養(yǎng)，雙飲水瓶均裝潔凈自來水，自由飲水?dāng)z食）；Handle（5min/天將動(dòng)物放在手上輕柔把玩）（測(cè)試開始于測(cè)試結(jié)束時(shí)均要稱量記錄水瓶重量）；
2. Day4：雙瓶均為水（測(cè)試開始與測(cè)試結(jié)束時(shí)均要稱量記錄水瓶重量，剔除有飲水偏好的動(dòng)物）；
3. Day5：雙瓶均為1-2%糖水（測(cè)試開始與測(cè)試結(jié)束時(shí)均要稱量記錄水瓶重量）；
4. Day6：8am-2pm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物可自由攝取兩瓶水/糖水（測(cè)試開始與測(cè)試結(jié)束時(shí)均要稱量記錄水瓶重量）。

04.數(shù)據(jù)分析方法

糖水比例（%）=【糖水?dāng)z入量/（糖水?dāng)z入量+水?dāng)z入量）】*100%同時(shí)也可以分析舔舐次數(shù)變化。

*注意事項(xiàng)

1. 水瓶滴漏：避免水瓶地漏，造成稱量重量出現(xiàn)偏差
2. 品系差異：如，李斯特（Lister）帶帽的大鼠在濃度為1％時(shí)顯示出明顯的蔗糖偏愛，而威斯塔（Wistar）大鼠則沒有。與C57BL / 6J小鼠相比，129P3 / J小鼠對(duì)蔗糖或麥芽糊精加糖溶液的偏愛性較低
3. 性別差異：如，Wistar Kyoto雄性大鼠的蔗糖偏愛率低于雌性。京都Wistar雄性大鼠表現(xiàn)出應(yīng)激誘導(dǎo)的蔗糖偏愛損失，而雌性則沒有。相反，雄性和雌性Sprague Dawley大鼠在慢性輕度應(yīng)激后均表現(xiàn)出蔗糖偏愛的降低