腫瘤干細(xì)胞研究套路：Wnt信號通路的激活

研究背景

人的子宮內(nèi)膜是一種高度再生的組織，在類固醇誘導(dǎo)下，每個月都有增殖、分化和脫落的周期。有證據(jù)表明，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞存在于子宮內(nèi)膜中，并負(fù)責(zé)子宮內(nèi)膜每月的周期性再生。子宮內(nèi)膜在循環(huán)卵巢類固醇激素、雌激素和孕激素的影響下發(fā)生再生性改變。子宮內(nèi)膜癌也被證實含有能自我更新的腫瘤干細(xì)胞亞群。這些具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞負(fù)責(zé)腫瘤生長和化療耐藥性。多種細(xì)胞表面蛋白已被成功鑒定為各種類型癌癥的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，而在子宮內(nèi)膜癌中CD133和CD44蛋白被用于富集腫瘤干細(xì)胞，目前缺乏子宮內(nèi)膜腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。

SMOC-2是SPARC家族成員之一，在胚胎發(fā)生和傷口愈合過程中高度表達(dá)。該基因產(chǎn)物是一種基質(zhì)細(xì)胞蛋白，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，以及血管生成活性。已有研究表明，SMOC-2可能在性腺和生殖道發(fā)育過程中介導(dǎo)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞類型特異性分化。此外，SMOC-2已被證明是腸道干細(xì)胞的特征基因且對于L1介導(dǎo)的腸癌發(fā)展是必需的。因此作者想探索SMOC-2是否與子宮內(nèi)膜癌腫瘤干細(xì)胞之間存在關(guān)聯(lián)。

研究結(jié)果

為了確定SMOC-2與腫瘤干細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)，作者通過流式分別分選出的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系A(chǔ)N3CA和Ishikawa的CD133+/CD44+細(xì)胞以及CD133-/CD44-細(xì)胞（CD133和CD44已經(jīng)被廣泛地認(rèn)為是多種類型癌癥中的腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物），經(jīng)Western blot及qPCR驗證，SMOC-2在CD133+/CD44+中的表達(dá)顯著高于CD133-/CD44-細(xì)胞，提示了SMOC-2與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)。

圖1.SMOC2在CD133+/CD44+細(xì)胞中的表達(dá)。

作者進(jìn)一步通過siRNA敲低SMOC-2以及慢病毒構(gòu)建過表達(dá)SMOC-2的細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)敲低SMOC-2后，已鑒定的干細(xì)胞相關(guān)基因SOX2、OCT4和NANOG表達(dá)發(fā)生了下調(diào)，而過表達(dá)SMOC-2則使得這些干細(xì)胞相關(guān)基因上調(diào)。這些結(jié)果證明了SMOC-2促進(jìn)子宮內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

圖2. SMOC2促進(jìn)干性相關(guān)基因的上調(diào)。

體外的細(xì)胞實驗證明了SMOC-2促進(jìn)細(xì)胞的成球以及增殖之后，作者通過構(gòu)建CDX模型（cell-derived xenograft model）進(jìn)一步評估SMOC2對癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤的影響。通過構(gòu)建慢病毒穩(wěn)定敲低SMOC-2的細(xì)胞株，將其皮下注射入免疫缺陷的裸鼠體內(nèi)，研究人員發(fā)現(xiàn)，與對照組相比敲低SMOC-2后顯著抑制了癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。

圖3. SMOC-2對癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響。

由于腫瘤干細(xì)胞具有抵抗化療的能力，因此作者通過成球?qū)嶒炘u估了SMOC-2在癌細(xì)胞抵抗化療藥物（如順鉑Cisplatin和紫杉醇Paclitaxel）中的作用，發(fā)現(xiàn)了SMOC-2過表達(dá)的癌細(xì)胞能夠顯著抵抗順鉑以及紫杉醇對于癌細(xì)胞生長抑制的影響。證明了SMOC-2介導(dǎo)了子宮內(nèi)膜癌的化療抵抗。

圖4. SMOC-2對癌細(xì)胞化療抵抗的影響。

在驗證了SMOC-2的促癌功能之后，作者接下來研究其作用機(jī)制，由于Wnt通路、Hedgehog通路和Notch通路等發(fā)育相關(guān)的通路在腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用。作者通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)Wnt信號通路活性在SMOC-2敲低后被抑制，而在SMOC-2過表達(dá)后則顯著提高，而其他通路則無影響。此外，Wnt通路的靶基因MYC以及CCND1在SMOC-2被敲低后也發(fā)生了下調(diào)。最后，作者通過免疫熒光實驗證明了Wnt通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子β-catenin在SMOC-2過表達(dá)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中從細(xì)胞質(zhì)中易位入核，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，作者通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灒�通路靶基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子的免疫熒光實驗三種方法證明了SMOC-2激活Wnt信號通路。

圖5. SMOC-2激活Wnt信號通路。

在體外的細(xì)胞水平層面以及體內(nèi)的動物水平層面都驗證了SMOC-2對于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞功能的影響之后，作者通過收集子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化（IHC）染色進(jìn)行臨床水平層面的驗證，發(fā)現(xiàn)了低表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44的腫瘤標(biāo)本同樣低表達(dá)SMOC-2，而高表達(dá)CD133和CD44的腫瘤標(biāo)本中同樣高表達(dá)SMOC-2。因此在臨床水平層面上驗證了SMOC-2與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)聯(lián)。

圖6. SMOC-2在臨床腫瘤樣本中的表達(dá)。

小結(jié)

文章作者抓住了近些年腫瘤研究的熱門主題“腫瘤干細(xì)胞”，利用了簡單又具有說服力的實驗對SMOC-2這個基因?qū)δ[瘤干細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中的功能及其作用機(jī)制進(jìn)行了完整的闡述。文章中，作者利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA穩(wěn)定敲低體系以及慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)體系進(jìn)行正反實驗論證，并且利用了CDX模型裸鼠實驗證明了SMOC-2在體內(nèi)的致瘤能力。

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參考文獻(xiàn)：

lu Huan., et al. Targeting cancer stem cell signature gene SMOC-2 Overcomes chemoresistance and inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma. EBioMedicine 2019 Feb; 40: 276–289.