重慶大學(xué)吳海波課題組揭示結(jié)核分枝桿菌免疫逃逸的新機(jī)制

如今，結(jié)核病仍是世界頭號(hào)的傳染病殺手。2018年，全世界估計(jì)有1000萬人新患上結(jié)核病，并有150萬人因此喪生。引起結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）通過呼吸道入侵人體并引起肺部病變。通常，宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別并清除結(jié)核分枝桿菌，以防止感染的進(jìn)一步擴(kuò)散。然而，這種細(xì)菌并不是那么容易對(duì)付的，它會(huì)想方設(shè)法逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。至于它是如何逃逸的，現(xiàn)在人們還沒有完全弄清楚。

重慶大學(xué)吳海波課題組近日通過調(diào)節(jié)宿主miR-325-3p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌新的免疫逃逸途徑。這不僅有助于了解結(jié)核分枝桿菌的免疫逃逸，還為耐藥結(jié)核病的療法開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。這項(xiàng)成果于2020年6月發(fā)表在mBio雜志上。

01 miR-325-3p與結(jié)核分枝桿菌的存活有關(guān)

吳海波課題組之前的研究表明，小鼠被結(jié)核分枝桿菌氣溶膠感染后，microRNA-325-3p（miR-325-3p）的表達(dá)上調(diào)。同樣地，他們發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，潛伏性結(jié)核病患者的miR-325-3p水平更高，表明這種miRNA在結(jié)核分枝桿菌的存活中發(fā)揮重要作用。

為了確定miR-325在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用，研究人員首先以感染結(jié)核分枝桿菌的RAW 264.7巨噬細(xì)胞為對(duì)象，分析了miR-325轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。他們發(fā)現(xiàn)，pri-miR-325、pre-miR-325和miR-325-3p的表達(dá)水平在感染后均增加。同時(shí)，小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDM）在感染后24小時(shí)也觀察到miR-325-3p的上調(diào)。

之后，他們又用miR-325-3p模擬物和抑制物來轉(zhuǎn)染RAW 264.7細(xì)胞。結(jié)果表明，在模擬物存在時(shí)，結(jié)核分枝桿菌的存活率得到了提高。相反，經(jīng)過抑制物處理后，結(jié)核分枝桿菌的存活受損。與野生型小鼠相比，Mir325敲除小鼠在感染結(jié)核分枝桿菌后的中位生存期顯著延長。這些數(shù)據(jù)表明，miR-325-3p在結(jié)核分枝桿菌感染后上調(diào)，且不利于宿主形成對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗力。

02 LNX1是miR-325-3p的直接靶點(diǎn)

接下來，研究人員分析了miR-325-3p在結(jié)核分枝桿菌感染期間是否靶向和調(diào)節(jié)特定的基因。他們通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-325-3p的靶點(diǎn)，并選擇Lnx1開展進(jìn)一步的研究。Lnx1的3’ UTR中含有miR-325-3p的特異性結(jié)合位點(diǎn)。他們將Lnx1的3’ UTR及其突變體克隆到熒光素酶報(bào)告載體后，與miR-325-3p模擬物一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。他們發(fā)現(xiàn)野生型3’ UTR中的熒光素酶活性下調(diào)，而突變體則沒有下調(diào)。

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-325-3p在調(diào)節(jié)LNX1中的作用，研究人員又通過Western blotting評(píng)估了LNX1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LNX1在miR-325-3p模擬物存在時(shí)受到抑制，而在miR-325-3p抑制物存在時(shí)上調(diào)。他們接著用γ射線照射的結(jié)核分枝桿菌來感染野生型小鼠的BMDM細(xì)胞以及RAW 264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)感染阻止了兩種巨噬細(xì)胞中LNX1的表達(dá)，但來源于Mir325缺陷型小鼠的BMDM中卻未出現(xiàn)這種現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，miR-325-3p靶向LNX1，抑制其在結(jié)核分枝桿菌感染期間表達(dá)。

03 LNX1促進(jìn)NEK6的多聚泛素化

那么，LNX1在結(jié)核分枝桿菌感染期間發(fā)揮了什么樣的作用？研究人員首先利用酵母雙雜交系統(tǒng)來篩選LNX1的相互作用蛋白。通過軟件預(yù)測和Western blotting篩選，他們選擇了NEK6，這是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在幾種組織中普遍表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，NEK6的變化與LNX1呈負(fù)相關(guān)。體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)均表明，LNX1是NEK6的負(fù)向調(diào)控分子。

之后的免疫共沉淀和體內(nèi)pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LNX1與NEK6之間存在著直接的相互作用。他們還發(fā)現(xiàn)，miR-325-3p過表達(dá)抑制了NEK6-LNX1相互作用，而miR-325-3p抑制則增強(qiáng)了這種相互作用。由于LNX1與NEK6之間存在反向關(guān)聯(lián)，故研究人員分析了LNX1存在或不存在時(shí)的NEK6多聚泛素化。后續(xù)研究表明，LNX1是一種E3泛素連接酶，它直接與NEK6結(jié)合，并促進(jìn)NEK6的多聚泛素化以及蛋白酶體介導(dǎo)的降解。

04 NEK6通過激活STAT3而抑制細(xì)胞凋亡

接下來，研究人員進(jìn)一步研究了NEK6在結(jié)核分枝桿菌存活中的特定作用。由于NEK6是一種靶向STAT3的蛋白激酶，因此他們首先關(guān)注了結(jié)核桿菌感染期間STAT通路的調(diào)控。在感染24小時(shí)后，STAT3的磷酸化水平上調(diào)。而Nek6敲除小鼠（賽業(yè)生物構(gòu)建）的BMDM和器官中則表現(xiàn)出相對(duì)較低的STAT3磷酸化水平。

眾所周知，STAT3是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，可響應(yīng)細(xì)胞刺激介導(dǎo)多個(gè)基因的表達(dá)，在許多細(xì)胞進(jìn)程（如凋亡和免疫應(yīng)答）中起關(guān)鍵作用。因此研究人員測試了下游可以直接由STAT3調(diào)控的基因。野生型小鼠的BMDM在被結(jié)核分枝桿菌感染期間，抗凋亡BCL-2基因家族的表達(dá)上調(diào)，而Nek6敲除小鼠的BMDM則沒有這種現(xiàn)象。因此，NEK6充足的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡抑制作用，這有利于結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活。如此看來，NEK6通過STAT3的磷酸化調(diào)控先天免疫應(yīng)答，并參與結(jié)核分枝桿菌感染期間的細(xì)胞凋亡調(diào)控。

綜上所述，研究人員通過調(diào)節(jié)宿主miR-325-3p的表達(dá)而發(fā)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌新的免疫逃逸途徑：miR-325-3p靶向LNX1并阻礙了巨噬細(xì)胞中NEK6的蛋白酶體降解，NEK6的異常積累導(dǎo)致STAT3信號(hào)的激活，從而使細(xì)胞凋亡受到抑制，并促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活。

miR-325-3p促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌免疫逃逸的示意圖

原文檢索：

Fu B, Xue W, Zhang H, Zhang R, Feldman K, Zhao Q, Zhang S, Shi L, Pavani KC, Nian W, Lin X, Wu H. 2020. MicroRNA-325-3p facilitates immune escape of Mycobacterium tuberculosis through targeting LNX1 via NEK6 accumulation to promote anti-apoptotic STAT3 signaling.

DOI：https://doi.org/10.1128/mBio.00557-20.