Ella Simple ELisa檢測技術在宿主細胞蛋白質(zhì)（HCP）殘留的應用
宿主細胞蛋白質(zhì)（HCP）殘留，是重組治療性蛋白質(zhì)、重組疫苗及重組抗體藥物工藝過程中產(chǎn)生的宿主細胞蛋白質(zhì)及其修飾體。
HCP殘留是工藝穩(wěn)定性監(jiān)測的重要評價指標，是重組疫苗及重組抗體類藥物的重要質(zhì)控指標，ELISA法是各國藥典推薦方法。美國FDA推薦值：1-100ppm（ppm：百萬分之一），中國藥典重組疫苗個論，CHO細胞HCP小于0.05%（相當于小于500ppm）。--HCP的來源--
※與宿主細胞相關※
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宿主細胞產(chǎn)生的與先天免疫（Toll樣受體）相關的鞭毛蛋白
Toll樣受體（TLR）是先天免疫系統(tǒng)的一部分，在哺乳動物之間高度保守。它們已進化為對外來病原體，尤其是細菌，提供一線反應，產(chǎn)生免疫應答。鞭毛蛋白（一種常見的蛋白質(zhì)）大量存在于所有鞭毛細菌中，包括用于生產(chǎn)重組生物治療藥物的大腸桿菌之中。鞭毛蛋白具有較強的抗原性，可以與人類Toll樣受體中的TLR5結合，啟動免疫應答。因此，宿主細胞產(chǎn)生的HCP如鞭毛蛋白，可作為免疫原刺激機體產(chǎn)生抗HCP抗體，所以需在質(zhì)量控制時進行監(jiān)控（因觸發(fā)TLR可能引起敗血性休克）。
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宿主細胞產(chǎn)生的酶類
宿主細胞產(chǎn)生的活性酶，例如組織蛋白酶D，可以與mAb中的特定序列結合，從而使抗體降解。其它由宿主細胞產(chǎn)生的溶酶體磷脂酶A2和纖維素酶可以直接影響賦形劑的穩(wěn)定性，從而影響產(chǎn)品制劑的穩(wěn)定性。
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宿主細胞產(chǎn)生的細胞因子雜質(zhì)
細胞因子是一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質(zhì)。細胞因子一般通過結合相應受體調(diào)節(jié)細胞生長、分化和效應，調(diào)控免疫應答。高度保守的細胞因子，也可在宿主細胞中表達。如宿主細胞中產(chǎn)生的細胞因子，如MCP-1或TGF-β1，在產(chǎn)品純化中未能達到很好監(jiān)控，則臨床上易發(fā)生患者組胺釋放等不良反應事件。
※與產(chǎn)品相關※
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宿主細胞產(chǎn)生產(chǎn)品的同源物
宿主細胞產(chǎn)生與產(chǎn)品同源的HCP產(chǎn)物，例如在對早期生物藥物之一重組人組織纖溶酶原激活劑（tPA，Activase，Genentech）進行表征的過程中，觀察到一個較小的變異。進一步的研究表明，這是從用于生產(chǎn)該產(chǎn)品的CHO細胞中共純化倉鼠纖溶酶原激活劑（PA）。且兩種蛋白之間存在大約80％的同源性。如果HCP是產(chǎn)品的同源物，并且可以在宿主細胞中表達，則會具有相似的色譜特性，從而實現(xiàn)共純化。但在臨床試驗期間安全性數(shù)據(jù)表明，即使含有PA這種HCP，該藥物總體上的風險水平是可接受的。但由于對于大多數(shù)治療適應癥（中風，心肌梗塞，肺栓塞）的患者，tPA是單次靜脈注射，因此容易導致雜質(zhì)的免疫原性。
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宿主細胞產(chǎn)生產(chǎn)品靶點的同源物
如果宿主細胞產(chǎn)生的人源化或人單克隆抗體（mAb）可以與目標蛋白的倉鼠同源物發(fā)生反應，那么這種HCP會將通過純化系統(tǒng)進行攜帶。例如AntigenA是一種與目標疾病有關的肽，它在物種之間是高度保守的，因此會在CHO系統(tǒng)表達。當mAb與AntigenA特異性結合后，mAb會將此類蛋白質(zhì)帶入最終產(chǎn)物。雖然此類HCP可以通過下游處理在某種程度上清除。盡管如此，生物制藥生產(chǎn)商應了解其靶蛋白的宿主細胞同源物，并設計純化和控制系統(tǒng)來解決此問題。
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宿主細胞產(chǎn)生與產(chǎn)品非特異性結合的HCP
--HCP帶來的影響--
※免疫原性※
HCP在患者中可能具有直接的生物學活性，例如觸發(fā)Toll-Like受體介導的先天免疫反應，或者直接由宿主細胞產(chǎn)生的細胞因子刺激機體，產(chǎn)生組胺，發(fā)生炎癥反應。對于一些與產(chǎn)品非特異性結合的HCP，則可直接在機體內(nèi)產(chǎn)生抗體，增加病人體內(nèi)的抗體滴度。
※佐劑效應※
HCP可以是免疫原性的，直接引發(fā)針對特定HCP雜質(zhì)的抗體。但同時也可以作為佐劑，從而增加機體對治療蛋白的免疫反應，及產(chǎn)生抗抗體“ADA”，從而直接影響藥物在生物分布，藥代動力學和生物活性。
※產(chǎn)品穩(wěn)定性※
HCP雜質(zhì)同樣會影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性，從而影響生物藥物的使用。例如宿主細胞產(chǎn)生的蛋白酶，直接與某些抗體的降解有關。也有研究報道，一些由CHO或大腸桿菌衍生的HCP可以影響賦形劑聚山梨酯20和聚山梨酯80的穩(wěn)定性，從而影響藥物的儲存。
--CHO HCP的檢測方法--
中國倉鼠卵巢（CHO）細胞被廣泛用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)。在這些蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程中，宿主細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)生的宿主細胞蛋白質(zhì)（HCP），被作為來自過程中的相關雜質(zhì)而被共純化，對接受治療性蛋白的患者造成潛在的免疫原性風險。因此，在生物制藥藥物開發(fā)中，需要監(jiān)測與過程相關的HCP的含量。監(jiān)管機構要求最終藥品中的HCP含量必須小于100 ppm，但仍需藥物生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)方法以量化IP（in-process）和最終原料藥DS（drug substance）中的HCP含量，以證明HCP清除率。
ELISA是在1970年代開發(fā)的，利用抗體在96或384孔微孔板中定量感興趣的特定抗原。 ELISA有多種類型，例如直接，間接，三明治和競爭性ELISA。在所有類型中，檢測都取決于抗體和抗原的結合方式。通常，雙抗體夾心ELISA用于定量HCP。
但是，傳統(tǒng)Elisa檢測HCP具有以下缺點：
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多次手動操作（即緩沖液，洗滌步驟，抗體和抗原添加，樣品添加，孵育步驟）；
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需要優(yōu)化緩沖液，以使“捕獲”抗體與微孔板的連接穩(wěn)定。否則，它將無法捕獲樣品，從而導致檢測和比色響應不足；
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試劑孵育長或短時間可能導致假陽性或假陰性結果，因此需要考慮板的顯影時間；
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操作時間長，一般為5-7小時；
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樣品上樣量大，需要100-200μl。
--Ella CHO HCP檢測--
Ella CHO HCP 3G使用微流體代替板清洗和加載步驟來測量抗原濃度（圖1A）。所有實驗性免疫測定步驟均在精心設計的帶有三個單獨的玻璃納米反應器（GNR）的單個通道中進行。捕獲抗體固定在GNR上，而抗原樣品和檢測抗體（生物素化抗體和SA-dyelite650）都從特定的入口通道流到GNR（圖1B）。
全程Ella分析只需三個步驟：
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向孔中添加25μl樣品；
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將Cartridge放入Ella儀器中進行全自動的樣品上樣；
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Ella自動抗體孵育及檢測。
在每個實驗運行結束時，每個樣品有三個單獨的數(shù)據(jù)點，分別對應于每個孔中的三個GNR。所有孵育均在一個步驟中進行（傳統(tǒng)ELISA需對單個樣品數(shù)據(jù)點有多種操作）。此外，可以將標準曲線以“條形碼”的形式內(nèi)置到Ella里，無需再做標準曲線。
Ella CHO HCP與Elisa檢測HCP清除率的可比性研究
Ella CHO HCP與Elisa檢測多個抗體HCP的精密度的可比性研究
Ella CHO HCP與Elisa檢測多個抗體HCP的準確性的可比性研究
總結：
Ella CHO HCP檢測可以在IP開發(fā)為DS期間，加快對CHO HCP雜質(zhì)進行與開發(fā)相關決策的速度。Ella的軟件支持GMP，并且可以在GMP實驗室中建立。Ella只需75分鐘的分析時間，可以加速藥品的批量釋放。此外，Ella還擁有多因子檢測的能力，可以將CHO HCP和這些共純化的HCP（具有免疫原性或穩(wěn)定風險的酶類）都可以在一個測定板上同時進行分析。
參考文獻: Experience with Host Cell Protein Impurities in Biopharmaceuticals,Biotechnol Prog. 2018 Jul;34(4):828-837.
