木絲霉pCR檢測(cè)試劑盒檢驗(yàn)方法

木絲霉pCR檢測(cè)試劑盒標(biāo)本要求
人體鼻腔或咽部分泌物:用無(wú)菌捻拭子拭取鼻腔或咽部分泌物，將分泌物或咽拭子置入無(wú)菌玻璃管（含0.4ml滅菌生理鹽水），用無(wú)菌棉球?qū)⒃嚬苋�緊后，密閉送檢。標(biāo)本可立即用于檢測(cè)，也可保木絲霉pCR檢測(cè)試劑盒檢驗(yàn)方法：
.標(biāo)本、對(duì)照品的核酸裂解處理
用商品化（取得醫(yī)療器械許可證）的RNA提取試劑盒處理標(biāo)本，具體操作參見(jiàn)該試劑盒說(shuō)明書(shū)。
或用Trizol法提取，方法如下：取00?l樣品置于.5ml 離心管中，加入300?l裂解液（Trizol），再加入00， 混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒混勻5次； 3000rpm離心5min， 吸取上層液體，加入等體積異丙醇，顛倒混勻室溫靜置0min， 3000rpm離心0min，輕輕倒去上清；加入700?l 75%乙醇，顛倒洗滌，3000rpm離心5min，輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，棄盡液體或4000rpm離心5sec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量吸干液體，加入20?l DEPC-H2O溶解RNA。
2.試劑配制
取n×9?l H7N9核酸熒光PCR檢測(cè)混合液與n×?l RT-PCR酶（n為反應(yīng)管數(shù)）,振蕩混勻數(shù)秒, 3000rpm離心數(shù)秒。
3.加樣取上述混合液20?l置于PCR管中，然后將樣品核酸提取液、DEPC-H2O、陽(yáng)性對(duì)照品各5?l分別加入PCR管中，蓋好管蓋，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
4. PCR擴(kuò)增反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
45℃×0min; 95℃×5min;循環(huán)一次，再按95℃×5sec→60℃×60sec，循環(huán)45次;單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃，反應(yīng)體系為25?l。