腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶使用方法

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶測(cè)定原理

AGP催化的逆向反應(yīng)生成GP，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測(cè)定NADPH增加速率，即可計(jì)算AGP活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制

提取液：液體30mL×瓶，4℃保存;

試劑一：液體0mL×瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×支，4℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑三：粉劑×瓶，4℃保存；臨用前加入2mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑四：粉劑×瓶，4℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑五：粉劑×瓶，-20℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑六：粉劑×支，-20℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑七：粉劑×支，-20℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；

粗酶液制備

稱取約0.g組織加入mL提取液，冰浴中勻漿。0000g ，4℃離心0min，取上清，置冰上待測(cè)。AGP活性計(jì)算

、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

AGP活性（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積（700μL ）÷樣本體積（20μL ）÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×0-3）×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=283×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

此法需要自行測(cè)定粗酶液蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP活性（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（700μL ）÷樣本體積（20μL ）÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×0-3）×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) =283×ΔA÷樣本鮮重(g/mL)