新時(shí)代下對于Western Blotting發(fā)表文章的新要求（二）

 

上一期我們聊了期刊雜志的新要求，總結(jié)如下：
 

▶  不建議跑平行膠，因?yàn)槠叫心z和剝離膜，孵育體系，操作條件的不一致，影響定量的準(zhǔn)確性，因此最好內(nèi)參和目的蛋白要在同一張印跡膜上。

▶  選擇寬動(dòng)態(tài)范圍的方法，確認(rèn)信號(hào)強(qiáng)度與所上樣量之間的線性關(guān)系，例如用膠片做化學(xué)發(fā)光方法的動(dòng)態(tài)范圍就很窄，不建議使用。

▶  強(qiáng)烈推薦使用總蛋白進(jìn)行歸一化，因?yàn)榭醇业鞍兹菀资芴幚項(xiàng)l件影響而發(fā)生變化，影響定量的結(jié)果，使用總蛋白定量更真實(shí)地反映目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化。

▶  提交原始數(shù)據(jù)，例如：JBC，PLOS和CELL等雜志都要求要提供原始數(shù)據(jù)。
 

Azure公司除了有Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)可滿足需求， Azure600多功能分子成像系統(tǒng)也可幫助您獲得期刊雜志要求的Western Blot數(shù)據(jù)：

 

 

▶ Azure600標(biāo)配有5個(gè)熒光光源，可同時(shí)在一張印跡膜上進(jìn)行4通道熒光成像 ，同時(shí)也具有高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測功能，靈敏度可達(dá)fg級(jí)

 

熒光Western Blot使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測，膜上的靶標(biāo)蛋白濃度與可見熒光信號(hào)強(qiáng)度呈線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)真實(shí)可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白檢測。這樣目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白在同一張膜上，可以避免數(shù)據(jù)造假的情況發(fā)生，更容易被期刊雜志接收。

 

 

圖1：通過使用四種光譜不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，可以同時(shí)檢測多達(dá)四種不同的蛋白。HeLa細(xì)胞裂解物上樣，Anti-Tubulin (550nm, 綠色), Anti-Actin (700nm紅色), Anti-GAPDH (800nm, 灰色),和Anti-Transferrin (490nm, 藍(lán)色)這四種蛋白同時(shí)成像，沒有交叉。

 

▶ Azure600近紅外采用激光光源， 激發(fā)強(qiáng)度大，單色性好，減少光泄漏，在更短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到更好的信噪比，Western Blot精準(zhǔn)定量的金標(biāo)準(zhǔn)
 

 

▶ Azure600配合AzureRed總蛋白熒光染色劑可以做總蛋白歸一化和定量三個(gè)靶標(biāo)蛋白，生成可以信賴的定量Western Blot數(shù)據(jù)

 

使用總蛋白歸一化，以校正泳道和樣品之間的差異。傳統(tǒng)的方法無法準(zhǔn)確知道條帶灰度值和強(qiáng)度的變化是由于樣品的生物學(xué)變化引起的，還是由于上樣不一致性或樣品制備的差異引起的�？偟鞍锥�量的優(yōu)勢如下：
 

★ 總蛋白比看家基因等內(nèi)參的線性檢測范圍更寬；

★ 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)和系統(tǒng)中更加穩(wěn)定；

★ 能有效排除實(shí)驗(yàn)條件和體系對結(jié)果的影響；

★ 更真實(shí)地反映目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化。

 

圖2.總蛋白歸一化和定量三個(gè)靶標(biāo)蛋白. Tubulin 紅色通道, Actin 藍(lán)色通道,GAPDH綠色通道, AzureRed/Total protein 用灰色表示
 

圖3.使用總蛋白對Tubulin信號(hào)進(jìn)行歸一化糾正上樣誤差

 

▶Azure600標(biāo)配9.1MP的高分辨CCD，動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)4.8OD，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性
 

圖4.過飽和檢測可防止定量誤差，相同的印跡膜分別使用膠片成像和Azure成像系統(tǒng)，Azure成像系統(tǒng)具有過飽和提醒，自動(dòng)計(jì)算曝光時(shí)間以避免飽和

 

▶ Azure600可做彩色Marker與化學(xué)發(fā)光條帶的自動(dòng)整合，分子量查看更直觀
 

 

▶ Azure600提供原始數(shù)據(jù)16bit的tiff圖給到期刊，這里的tiff原始數(shù)據(jù)是指未經(jīng)裁剪，像素修改，對比度調(diào)整等任何操作的圖，保證結(jié)果的真實(shí)性和可靠性

 

Azure600除了進(jìn)行熒光印跡膜，化學(xué)發(fā)光印跡膜檢測外，還可以進(jìn)行普通凝膠成像，EMSA檢測，菌落篩選，小動(dòng)物成像，植物成像等。

 

 

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