深度解讀新型冠狀病毒感染與免疫機(jī)制

2019年12月爆發(fā)的新型冠狀病毒，給我國人民生活帶來了巨大的影響。那么，什么是新型冠狀病毒呢？人類如何科學(xué)防御并治療冠狀病毒呢？相信大家對(duì)這個(gè)問題既熟悉又陌生，熟悉的是我們身處其中，每天都對(duì)這個(gè)病毒戰(zhàn)戰(zhàn)兢兢，陌生的是我們對(duì)新冠病毒的了解并不是很透徹，致使截至目前，我們依然沒有辦法完全消除他的存在。知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。要防御和治療2019-nCoV，我們需要對(duì)其感染和免疫機(jī)制有深入的了解。

 

1、冠狀病毒是什么

 

冠狀病毒（CoV）是屬于Nidovirales的最大病毒組，其中包括冠狀病毒科，Arteriviridae, Mesoniviridae和Roniviridae家族。冠狀病毒進(jìn)一步可細(xì)分為四個(gè)屬，即α，β，γ和δ冠狀病毒，其中α和β冠狀病毒會(huì)引起人類的呼吸道和腸道感染，有四種Human-CoV （HCoV 229E、NL63、OC43和HKU1）在全球流行，占成人呼吸道感染的10%至30%。

 

冠狀病毒屬的病毒是具有外套膜（envelope）包裹的RNA病毒，其直徑約100-160nm，遺傳物質(zhì)在所有RNA病毒中最大。包裹病毒粒子的脂肪膜表面有三個(gè)糖蛋白：棘突糖蛋白（S, SpikeProtein,是受體結(jié)合位點(diǎn)、溶細(xì)胞作用和主要抗原位點(diǎn)）；小包膜糖蛋白（E, EnvelopeProtein，較小，與胞膜結(jié)合的蛋白）；膜糖蛋白（M，MembraneProtein，負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸、新生病毒出芽釋放與病毒外包膜的形成）。少數(shù)種類還有血凝素糖蛋白（HE蛋白，Haemaglutinin－esterase）。病毒主要通過Spike蛋白（S蛋白）與宿主細(xì)胞受體結(jié)合來介導(dǎo)病毒的入侵，并決定病毒的組織或宿主嗜性。冠狀病毒S蛋白S1亞單位的N端結(jié)構(gòu)域（S1-NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（S1-CTD）都能作為受體結(jié)合域（RBD）。一般認(rèn)為S1-NTD結(jié)合糖類受體，S1-CTD結(jié)合蛋白類受體。

 

圖1 冠狀病毒結(jié)構(gòu)示意圖（引自Jie Cui et al. 2019）

 

冠狀病毒的核酸為非節(jié)段單鏈（+）RNA，長(zhǎng)27-31kb，是RNA病毒中最長(zhǎng)的RNA核酸鏈，具有正鏈RNA特有的重要結(jié)構(gòu)特征：即RNA鏈5’端有甲基化“帽子”，3’端有PolyA“尾巴”結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)與真核mRNA非常相似，也是其基因組RNA自身可以發(fā)揮翻譯模板作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因而省去了RNA－DNA－RNA的轉(zhuǎn)錄過程。冠狀病毒的RNA和RNA之間重組率非常高，病毒出現(xiàn)變異正是由于這種高重組率。重組后，RNA序列發(fā)生了變化，由此核酸編碼的氨基酸序列也變了，氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)隨之發(fā)生變化，使其抗原性發(fā)生了變化，因此疫苗的研發(fā)也受到了限制。

 

2019年12月在湖北武漢出現(xiàn)的不明原因肺炎病例，經(jīng)序列測(cè)定，專家發(fā)現(xiàn)，其與2003年爆發(fā)的SARS-CoV病毒存在79.5%的序列同源性，結(jié)合電鏡下觀察的圖片，中國疾控中心將引起不明原因肺炎病毒命名為2019-nCoV。2019-nCoV具有冠狀病毒的基本特征，是β冠狀病毒屬。研究者對(duì)2019-nCoV樣本進(jìn)行了RNA全長(zhǎng)測(cè)序，研究發(fā)現(xiàn)2019-nCoV在整個(gè)基因組中與蝙蝠冠狀病毒RaTG13非常相似，整體基因組序列一致性為96.2%。截至目前，專家認(rèn)為病毒的來源可能為菊頭蝠，但最終導(dǎo)致人傳人情況的發(fā)生，是由于中間宿主的存在以及病毒變異致使其適應(yīng)人類細(xì)胞的生存而導(dǎo)致的。

 

2、SARS-CoV, MERS-CoV, 2019-nCoV特征及聯(lián)系

 

圖2 不同冠狀病毒基因組，基因和蛋白質(zhì)（引用Jie Cui et al. 2019）

 

冠狀病毒形成直徑為100-160 nm的包膜球形顆粒。它們包含大小為27-32 kb的正鏈單鏈RNA（ssRNA）基因組。基因組的5’端三分之二編碼一個(gè)多蛋白pp1ab，該蛋白進(jìn)一步被切割成16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，它們參與基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。3’末端編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括包膜糖蛋白（S），包膜（E），膜（M）和核衣殼（N）。除了編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因外，還有一些輔助基因，這些輔助基因是物種特異性的，對(duì)于病毒復(fù)制是不可或缺的。該圖比較了四種冠狀病毒屬的典型菌株和代表性菌株：貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV），犀牛蝙蝠冠狀病毒HKU2，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）菌株SAR02和SZ3來自流行早期感染的人，分別來自在SARS流行病的中期和晚期感染的人類的SARS-CoV毒株hTor02，蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒（SARSr-CoV）毒株，中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV），小鼠肝炎病毒（MHV），傳染性支氣管炎病毒（IBV）和球莖冠狀病毒HKU11。

 

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）是曾引起大規(guī)模傳染病爆發(fā)的冠狀病毒。SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV同屬于冠狀病毒。對(duì)于2019-nCoV新發(fā)病毒而言，我們對(duì)已有相關(guān)病毒的了解和研究策略對(duì)我們研究2019-nCoV有著重要的意義。

 

我們知道，SARS冠狀病毒（SARS-CoV）是以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE2）作為受體，主要感染纖毛支氣管上皮細(xì)胞和II型肺細(xì)胞。SARS-CoV S蛋白形成了三葉草形的三聚體，具有三個(gè)S1頭和一個(gè)三聚體S2莖。RBD位于每個(gè)S1頭的尖端。 RBD綁定到ACE2的外表面，遠(yuǎn)離其鋅螯合酶位點(diǎn)。有研究表明，不同的SARS-CoV菌株對(duì)人血管生成素受體蛋白（ACE2）的親和力不同，感染力和傳播力也不同。有些菌株感染人類，但并不在人類之間傳播，而有些菌株卻對(duì)人細(xì)胞具有高感染力，形成跨物種傳播。

 圖3 SARS- CoV和MERS- CoV的受體識(shí)別（引自Jie Cui et al 2019）

 

1. SARS-CoV使用其受體結(jié)合域（RBD）（如hTor02菌株的結(jié)構(gòu)所示，包含核心結(jié)構(gòu)（青色）和受體結(jié)合基序（RBM;品紅色）結(jié)合ACE2（綠色）。 ACE2是一種肽酶，其活性中心帶有鋅（藍(lán)色）。
2. 宿主和病毒受體中的幾個(gè)殘基，以及兩個(gè)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（虛線）形成兩個(gè)結(jié)合熱點(diǎn)的連接，這對(duì)于SARS流行株hTor02的結(jié)合至關(guān)重要。
3. 相比之下，SARS相關(guān)冠狀病毒（SARSr-CoV）株bWIV1是從蝙蝠中分離出來的，可以感染靈貓和人細(xì)胞，其殘基442、472和487不同。蘇氨酸突變?yōu)樘於�酰�?87號(hào)殘基中的A引入極性側(cè)鏈，并會(huì)干擾353位點(diǎn)的結(jié)合。此處顯示的模型是基于hTor02 RBD與人ACE2復(fù)合的結(jié)構(gòu)建立的，其中442、472和487位殘基從hTor02菌株突變?yōu)閎WIV1菌株。  
4. 蝙蝠SARSr-CoV株bRsSHC014也可以感染人和果子貍細(xì)胞。它在487位上帶有丙氨酸，并且該殘基的短側(cè)鏈不支持353的結(jié)合。其中442、480和487位殘基從cOptimize菌株突變?yōu)閎WIV1菌株。
5. 中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）RBD（青色的核心結(jié)構(gòu)和洋紅色的RBM）結(jié)合人二肽基肽酶4（DPP4；綠色）。

 

而MERS-CoV是以二肽激肽酶4（DPP4;也稱為CD26）作為受體，感染未分化的支氣管上皮細(xì)胞和II型肺細(xì)胞。DPP4蛋白作用于物種間氨基酸序列的大量轉(zhuǎn)化。其致病機(jī)制是感染下呼吸道并使下呼吸道上皮細(xì)胞高度易感，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中病毒的復(fù)制生產(chǎn)，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，靶向T淋巴細(xì)胞并導(dǎo)致其凋亡。到目前為止，科學(xué)家對(duì)于SARS-CoV、MERS-CoV對(duì)人體的侵襲研究并沒有終止，而如今2019-nCoV的突然爆發(fā)加速了科學(xué)家對(duì)冠狀病毒的研究。

 

2019-nCoV的爆發(fā)，是偶然也是必然。根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，它與SARS-CoV有著很高的同源性，它們擁有共同的祖先，其共同祖先與蝙蝠冠狀病毒HKU9-1類似。研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV和SARS-CoV都是通過病毒Spike蛋白與人體ACE2受體蛋白結(jié)合與宿主發(fā)生作用，二者的受體結(jié)構(gòu)域（RBD）高度同源。這里提到的ACE2是個(gè)什么蛋白呢？它又有著怎樣的功能呢？

 

在20世紀(jì)初的時(shí)候Donoghue發(fā)現(xiàn)了一種與人類ACE相關(guān)的羧肽酶，它是由805個(gè)氨基酸組成的I型膜結(jié)合糖蛋白，其活化位點(diǎn)位于第374-378位氨基酸殘基上，形成一個(gè)HEXXH鋅結(jié)合區(qū)，后來我們稱之為ACE2，即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2，它是一種能催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素-（1-9）或血管緊張素II轉(zhuǎn)化為血管緊張素-（1-7）的外肽酶，ACE基因表達(dá)廣泛分布于全身，而ACE2具有高度的組織特異性，主要分布于心臟，腎臟，肺內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，作為一種單羧基肽酶，ACE2能被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制。我們發(fā)現(xiàn)，ACE2在心腦血管疾病，腎臟疾病中被廣泛研究，也作為SARS-CoV和CoV-NL63冠狀病毒的受體被研究。

 

因此，當(dāng)研究者發(fā)現(xiàn)2019-nCoV與SARS-CoV的相關(guān)性之后，迅速展開了對(duì)ACE2蛋白的探究。我們是否可以在這個(gè)受體蛋白中找到突破口使得2019-nCoV即使存在在我們身體里也僅僅只是個(gè)過客呢？我們是否能在與病毒Spike變異的競(jìng)賽中搶先一步呢？這些都有待于進(jìn)一步的研究。

 

3、我們?nèi)绾畏烙�并治�?019-nCoV

 

知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。要防御并治療2019-nCoV，我們需要對(duì)其感染和免疫機(jī)制有深入的了解。

 

2020年1月25日，廣州中醫(yī)藥大學(xué)吳建國團(tuán)隊(duì)從免疫的角度提供了新冠狀病毒感染和防御的信息，研究者詳細(xì)表述了病原體識(shí)別受體（PRR）、Toll樣受體（TLR）、RIG-I樣受體（RLR）、NOD-樣受體（NLRs）、C型凝集素樣受體（CLR）、干擾素以及防御素等作用機(jī)制，并列舉了細(xì)胞參與免疫反應(yīng)時(shí)的響應(yīng)方式。作者指出，由于冠狀病毒周期性地，不可預(yù)測(cè)地出現(xiàn)，迅速傳播并誘發(fā)嚴(yán)重的傳染病，對(duì)人類健康造成極大的威脅。近年來，人們對(duì)病毒的固有免疫反應(yīng)有了深刻的理解。這種類型的免疫反應(yīng)抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)病毒清除，誘導(dǎo)組織修復(fù)，并引發(fā)針對(duì)病毒的長(zhǎng)期自適應(yīng)免疫反應(yīng)。在大多數(shù)情況下，與CoV相關(guān)的肺部和全身炎癥反應(yīng)是由先天免疫系統(tǒng)在識(shí)別出病毒時(shí)觸發(fā)的。

 

文中還提到靶向免疫療法，這是一個(gè)新的熱點(diǎn)。我們知道，基因靶向免疫療法即利用基因工程，利用多靶點(diǎn)排毒技術(shù)快速識(shí)別病毒，強(qiáng)力抑制并破壞病毒DNA核心，破壞病毒的同時(shí)采用基因免疫藥物，促進(jìn)宿主細(xì)胞抗原打破病毒免疫耐受，使病毒無法再次侵入。目前免疫療法在癌癥中應(yīng)用很多，我們以這種方式為突破點(diǎn)，或許可以應(yīng)對(duì)目前的2019-nCoV病毒，并對(duì)新產(chǎn)生的病毒不再手忙腳亂。

 

對(duì)于病毒與宿主的結(jié)合，人類還有哪些探索呢？有研究通過將2019-nCoV蛋白序列與SARS-CoV和BatSL-CoV序列對(duì)比，預(yù)測(cè)生成S1和S2亞基的切割位點(diǎn)位于R694/S695。如下圖所示。

 

圖4 2019-nCoV S蛋白功能性結(jié)構(gòu)域圖示（引自Shibo Jiang et al. 2020）

 

• RBD，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域； FP，融合肽；HR1，七肽重復(fù)1； HR2，七肽重復(fù)2； TM，跨膜結(jié)構(gòu)域； CP，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

 

S1亞基包含兩個(gè)功能域，N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD），兩者均負(fù)責(zé)病毒體與宿主細(xì)胞上的受體結(jié)合。S2亞基包含三個(gè)功能域，融合肽（FP）和肽重復(fù)序列（HR1和HR2），在S1中的RBD與受體結(jié)合后，S2亞基通過將FP插入宿主細(xì)胞膜而改變構(gòu)象，HR1和HR2形成六螺旋束（6HB），導(dǎo)致病毒膜與細(xì)胞膜融合。病毒遺傳物質(zhì)通過融合孔進(jìn)入宿主細(xì)胞并在細(xì)胞中復(fù)制。SARS-CoV S蛋白HR2結(jié)構(gòu)域的肽（SC-1）可以與病毒S蛋白中的HR1區(qū)相互作用形成異源6-HB，從而抑制了HR1和HR2結(jié)構(gòu)域之間同源6-HB的形成病毒S蛋白，從而阻斷了病毒與宿主細(xì)胞的融合。由于2019-nCoV S-HR2序列與SARS-CoV序列具有高度同源性，而在S-HR1區(qū)域中只有少數(shù)非關(guān)鍵氨基酸突變，因此SC-1肽也有望對(duì)2019-nCoV感染有效。研究還發(fā)現(xiàn)，中和性單克隆抗體（mAbs）和具有保護(hù)功效的納米抗體是S蛋白的S1亞基的特有化合物，特別是RBD，因此，2019-nCoV S-RBD也可作為2019-nCoV中和單抗的研究目標(biāo)。

 

下面講講免疫逃逸。為什么要提到這個(gè)？因?yàn)椴《厩秩胨拗�，其�?shí)就是宿主先天免疫與病毒固有免疫的對(duì)抗。病毒會(huì)抑制先天免疫反應(yīng)以獲得自身有效的復(fù)制方式和建立感染的機(jī)會(huì)。而宿主免疫反應(yīng)系統(tǒng)又會(huì)出現(xiàn)延遲或減弱，或者表現(xiàn)出延遲后過強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致組織損傷。受影響的先天免疫應(yīng)答會(huì)影響隨后的適應(yīng)性應(yīng)答，因此病毒先天免疫逃逸常常破壞宿主的保護(hù)性免疫，也就構(gòu)成了感染及發(fā)病的過程。

 

病毒到底行使的是怎樣的一個(gè)策略呢？病毒會(huì)將具有危險(xiǎn)性可識(shí)別特征的復(fù)制中間體與漫游在細(xì)胞質(zhì)中的先天免疫傳感器隔離開來。實(shí)際上，具有+ RNA基因組的病毒只能在胞質(zhì)溶膠中復(fù)制，例如侵入肺的冠狀病毒和鼻病毒，通常會(huì)精心修飾細(xì)胞內(nèi)膜以形成病毒RNA復(fù)制的總部，也稱為“復(fù)制細(xì)胞器”（RO）。病毒的免疫逃逸機(jī)制是如此機(jī)智聰明，機(jī)體免疫系統(tǒng)不能全部幫我們防御的話，那我們還有些什么策略可以對(duì)抗它呢？

 

病毒很強(qiáng)大，但并不是毫無辦法。除了上述提到的靶向免疫療法、SC-1肽，以及2019-nCoV S-RBD中和單抗，人類在積極的研發(fā)疫苗，篩選新的抗病毒藥物以及利用基因工程靶向免疫的方式去對(duì)抗病毒。這是一場(chǎng)比賽也是一場(chǎng)戰(zhàn)爭(zhēng)。

 

首先，對(duì)于疫苗的研發(fā)，我們要對(duì)病毒本身、病毒侵入宿主的方式、宿主的免疫反應(yīng)要有充分的了解。其次，藥物篩選，聯(lián)合用藥要考慮到對(duì)機(jī)體造成的副反應(yīng)，即最大程度減少后遺癥。再次，我們可以從基因功能層面研究病毒，精準(zhǔn)地治療病毒感染。針對(duì)2019-nCoV，有研究表明，冠狀病毒Spike蛋白與人類受體ACE2結(jié)合之后侵入肺細(xì)胞并對(duì)呼吸道進(jìn)行破壞。通過對(duì)基因功能分析，研究者發(fā)現(xiàn)ACE2+II型肺泡細(xì)胞表達(dá)多個(gè)與病毒組裝復(fù)制相關(guān)的功能基因，具體包括SLC1A5, CXADR, CAV2, NUP98, CTBP2, GSN, HSPA1B, STOM, RAB1B, HACD3, ITGB6, IST1, NUCKS1, TRIM27, APOE, SMARCB1, UBP1,CHMP1A, NUP160, HSPA8, DAG1, STAU1, ICAM1, CHMP5, DEK, VPS37B, EGFR, CCNK, PPIA, IFITM3, PPIB, TMPRSS2, UBC, LAMP1, CHMP3等。研究者認(rèn)為，這些基因可能被病毒“劫持”之后，以各種模式幫助病毒感染人體。例如CAV2表達(dá)Caveolin蛋白，可幫助細(xì)胞膜內(nèi)陷而使得細(xì)胞表面的病毒更容易被吞噬到細(xì)胞內(nèi)部。如果能設(shè)法基于現(xiàn)有的藥物或者研發(fā)新的藥物干預(yù)這些基因的功能，或許可以起到阻斷病毒感染的作用。

 

4、新病毒疫情爆發(fā)給我們的啟示

 

微生物與人類的戰(zhàn)爭(zhēng)從人類誕生起就開始了。人體免疫系統(tǒng)在進(jìn)化過程中逐漸完善，微生物尋找宿主并利用宿主的能力也變得強(qiáng)大。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類對(duì)生命本身的了解越來越深刻，我們擁有了去應(yīng)對(duì)各種變異病毒和細(xì)菌的能力，但是面對(duì)新病毒的爆發(fā)，我們依然要小心謹(jǐn)慎。管理是人類可為之的一個(gè)重要方面，科技特別是現(xiàn)在基因研究的成果應(yīng)用也是非常重要的一個(gè)方面，在努力配合國家指示的同時(shí)，我們要更努力的去了解2019-nCoV這個(gè)病毒，知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。

 

對(duì)于疫情，筆者有更重要的心得，便是，人與自然和諧相處，我們不驚擾了人世的安寧，大自然必饋贈(zèng)與我們一世的美景。

 

后記：

 

病毒研究是個(gè)艱巨的探索過程。不論是疫苗研發(fā)、新藥篩選還是基因治療，均需要精準(zhǔn)的動(dòng)物模型來驗(yàn)證疾病的發(fā)病機(jī)制和免疫機(jī)制。賽業(yè)生物作為一家成熟的動(dòng)物模型服務(wù)商，自疫情爆發(fā)以來便緊急召集公司的研發(fā)人員全力研發(fā)與新型冠狀病毒研究相關(guān)的動(dòng)物模型。賽業(yè)生物承諾會(huì)盡全力開發(fā)各種精準(zhǔn)的動(dòng)物模型支持科研人員的研究。眾志成城，有愛必勝，相信我們一定能打贏這場(chǎng)沒有硝煙的戰(zhàn)爭(zhēng)。

 

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