細胞培養(yǎng)不貼壁的常見處理辦法

我們可能都有過這樣的經歷：
辛苦呵護的細胞，怎么也不愿意貼壁；
貼壁了又很容易成塊或者成團掉下來；
原本貼壁的細胞，復蘇后細胞不貼壁了；
........
遇到這樣的問題你都如何解決？
這次我們就來聊聊
細胞貼壁和什么有關？
為啥你的細胞為這么矯情，不愿貼壁呢？
如何促進細胞貼壁？

 

首先并不是所有的細胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁，但大部分來自實體組織器官的細胞都會貼壁。

貼壁的過程可能是這樣的：細胞首先分泌細胞外基質，這種細胞外基質黏附在支持物的表面（培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面）。然后，細胞通過其表面表達的黏附因子與這些細胞外基質結合。

所以細胞貼壁與否和細胞本身分泌細胞外基質的能力以及細胞本身表達的黏附分子的數量有關，也與培養(yǎng)皿壁的表面結構有關。
 

細胞貼壁的過程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細胞形態(tài)改變是細胞內骨架（是真核細胞中的蛋白纖維網架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系）本身和細胞外基質共同作用的結果。

密度大于培養(yǎng)基的細胞（絕大部分細胞）會沉降在底面上，那么細胞要生存必定得改善這個環(huán)境，分泌細胞外基質，改善底面的結構，然后很自然就貼附在底面上了。

密度小于水的細胞，如脂肪細胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說，細胞貼壁是適應環(huán)境的一種反應。

參考文獻：劉梅芳， 徐國恒.  細胞體外培養(yǎng)時為什么會貼到培養(yǎng)皿壁上.生物學通報，2007，42（9）：54.
 

• 細胞的傳代最重要的是胰酶處理時間：消化不夠細胞本身就是成團的；若胰酶處理太久，容易造成細胞膜蛋白損傷，使細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。

• 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細胞的貼壁效果會下降很多。

• 支原體或細菌的污染。

• 培養(yǎng)液配置、儲存不當，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

• 復蘇的細胞本身狀態(tài)不好，已經老化，失去貼附性。

• 接種細胞數目太少，無法分泌足夠的細胞外基質。

• 復蘇時處理速度太慢，復蘇過程不當。

   

• 適度消化細胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

• 最好用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

• 正確配制消化液或培養(yǎng)液。

• 使用合適的細胞外基質或貼壁試劑。

• 復蘇新的細胞，第一周用20%血清幫助細胞復原。

• 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細胞抱團生長。

• 細胞傳代24小時之內，最好不要晃動，以免影響貼壁。

• 體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca²⁺含量和溫度，均有利于上皮細胞生長。

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