細(xì)胞形態(tài)異常，魚骨圖來幫忙（二）

上次的魚骨圖分析大家還沒有看過癮吧

這不，小編又雙叒叕來啦！

說完外源污染，那么接下來我們再從細(xì)胞層面討論討論

———內(nèi)源異常
 

內(nèi)源異常同樣也可以分為以下幾點(diǎn)

 人為選擇/突變
 老化
 細(xì)胞凍存/復(fù)蘇
 融合度過高才傳代（>90%）
傳代密度過低

接下來，我們將逐條為您剖析噢~

在體外培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，細(xì)胞會因操作過程而產(chǎn)生人為篩選：

1. 胰酶消化是最常被忽略的人為選擇過程，易被消化的細(xì)胞容易被傳代；
2. 細(xì)胞過度的分化或刺激時(shí)及可能造成細(xì)胞異常的突變，例如 HeLa cell雖然還保有人的基因序列，但染色體數(shù)目曾被觀察到有異常突變增加（原HeLa為46條，目前有研究人員觀察到70-90條染色體的案例）；
3. 文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)指出，hES 細(xì)胞株已被證實(shí)原位癌基因(TP53) 變異概率，隨著培養(yǎng)代數(shù)增加更易有突變產(chǎn)生 (Nature 2017)。

解決方案：

建立并記錄好細(xì)胞檔案（形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、有無支原體和潛存病毒等），為保障實(shí)驗(yàn)材料的一致性，應(yīng)將長期使用的細(xì)胞株建立細(xì)胞種子庫（Seed Stock）與工作庫（Working Stock）；細(xì)胞株建庫資料要詳細(xì)記載，并定期每3-6個(gè)月安排身份鑒定 （STR）。

美國細(xì)胞庫（ATCC）建議細(xì)胞株入庫的基本要求：

（1）培養(yǎng)簡歷 ：組織來源日期、物種、組織來源、供體正�；虍惓＝】禒顟B(tài)、性別、年齡、細(xì)胞已傳代數(shù)等；
（2）凍存液 、培養(yǎng)基和保護(hù)劑名稱；
（3）細(xì)胞活力 ，凍融前后細(xì)胞接種存活率和生長特性(細(xì)胞倍增時(shí)間，生長繁殖曲線，分裂指數(shù)等)；
（4）培養(yǎng)基種類和名稱、血清種類及濃度；
（5）細(xì)胞形態(tài)類型，如內(nèi)皮、上皮或成纖維細(xì)胞等；
（6）核型二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體有或無；
（7）無污染情況包括細(xì)胞、真菌、支原體、原蟲和病毒等；
（8）物種檢測，以證明細(xì)胞有無交叉污染；
（9）免疫檢測一兩種血清學(xué)檢測；
（10）細(xì)胞建立者姓名、檢測者姓名。    
  無論是原代細(xì)胞或是細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細(xì)胞會出現(xiàn)特征包括：細(xì)胞增殖變慢、細(xì)胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞扁平、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。
老化細(xì)胞不會立即死亡，但其基因表達(dá)會發(fā)生變化，如果細(xì)胞老化現(xiàn)象嚴(yán)重，建議從種子庫或工作庫重新復(fù)蘇細(xì)胞。

解決方案：

Dr. Cell可提供：細(xì)胞老化檢測（Cell Senescence Detection）
細(xì)胞老化檢測可準(zhǔn)確地判斷出老化細(xì)胞的百分比，以決定是否要使用代數(shù)更低的細(xì)胞，維持實(shí)驗(yàn)材料的一致性。細(xì)胞培養(yǎng)過程，防止衰老不二法門：還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種。一旦細(xì)胞衰老后，細(xì)胞很難再重新年輕化，此時(shí)，只能重新復(fù)蘇細(xì)胞。

   

 圖1.衰老細(xì)胞                圖2.正常細(xì)胞

慢凍快融

凍存細(xì)胞過程，建議程序降溫速度為1℃/min。細(xì)胞凍存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，冰晶的形成后會造成細(xì)胞損傷或細(xì)胞的死亡。為了保護(hù)細(xì)胞，凍存時(shí)會添加保護(hù)劑在凍存液中，目前多采用DMSO或甘油，使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對水的通透性。

復(fù)蘇細(xì)胞過程，讓細(xì)胞凍管在37℃環(huán)境快速解凍，待其全部快速融化，避免冰晶對細(xì)胞造成傷害；解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再更換新鮮完全培養(yǎng)液，以去除舊培養(yǎng)液中的DMSO; 如果擔(dān)心DMSO造成細(xì)胞毒性，可以待細(xì)胞解凍后將細(xì)胞緩慢加至含培養(yǎng)基離心管中離心，以稀釋DMSO的濃度。復(fù)蘇的細(xì)胞，約需數(shù)日或傳一至二代，其表現(xiàn)才會恢復(fù)穩(wěn)定。

解決方案：
掌握“慢凍快融”的原則，進(jìn)行程序降溫
慢凍→兩種辦法：

1.手動程序降溫，將細(xì)胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時(shí)）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。

2.程序降溫盒，一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱），使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。

快融：將凍存在液氮中的細(xì)胞凍存管快速移至已37℃預(yù)熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進(jìn)入凍存管造成潛在污染），使細(xì)胞冷凍懸液迅速融化；此做法能讓細(xì)胞冷凍懸液快速通過-20℃~0℃這個(gè)結(jié)晶形成溫度范圍，避免冰晶進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成二次傷害。

Biological Industries（BI）可提供：

中文名稱	貨號
無血清細(xì)胞凍存液	05-065-1
無血清間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液	05-712-1
無血清干細(xì)胞凍存液	05-710-1
D10無血清凍存液	05-713-1

一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過高（>90%）才傳代，容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞，即便再重新鋪盤傳代，細(xì)胞也無法回到原本的特性了。（如：單層細(xì)胞，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象）。

圖3

 

解決方案：

盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤。
細(xì)胞融合度：在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面（培養(yǎng)皿/瓶）所占的比例。

哺乳動物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細(xì)胞密度過低，細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)，就無法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號傳導(dǎo)并活化細(xì)胞；總體細(xì)胞量不足，分泌的生長因子濃度會不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境，以上皆會造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。

圖4

解決方案：

細(xì)胞傳代時(shí)，要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保鋪盤的密度。

如何確定細(xì)胞的正確初始接種密度? 美國細(xì)胞庫（ATCC）建議各類不同細(xì)胞株接種密度：

細(xì)胞類型	接種密度
常見腫瘤細(xì)胞株	2-4 x 106 viable cells/25cm2
成纖維細(xì)胞株	2-4 x 106 viable cells/25cm2
淋巴細(xì)胞/懸浮細(xì)胞	3-4 x 105 viable cells/ml
雜交瘤	2 x 105 viable cells/ml
成肌細(xì)胞	1-2 x 104 viable cells/cm2

https://www.atcc.org/support/faqs/8e032/Seeding%20Density%20for%20Cell%20Lines-25.aspx

小編溫馨提示：