多色流式中，如何讓熒光配色和諧共處地刷出存在感？
隨著科學研究的深入，我們對樣品指標的分析要求也越來越高，希望能夠在有限的樣品中獲取盡可能多的數(shù)據(jù)。多色流式就是一項為此量身定做的實用技術。但如何保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，在很大程度上取決于優(yōu)化的配色方案設計。
經(jīng)常會有初入流式分析的同學來問到，師兄，這個熒光強不強？這個通道能測出來不？是不是抗體不好使？為啥這個補償怎么也調(diào)不干凈？為啥（明明）感覺（應該）陽性群不明顯（很明顯）等等問題。其實導致這些問題的原因有很多，可能來源于抗體、熒光素的選擇，樣本處理，上機操作，及后續(xù)的分析過程中。本期，讓我們結合流式分析儀的基本原理，來看看多色流式中熒光配色的方案及其原理。
01、首先了解：流式分析的基本步驟
一次完整的流式分析，通�？梢愿爬樗牟阶�，【樣本制備】→【染色標記】→【上機操作】→【后續(xù)分析】。但是在成功地完成一次流式分析之前，我們還需要做大量的準備工作，我們可以將之分為【實驗設計】、【預實驗】。
行兵布陣講究的是謀定而后動，同樣地，做流式分析時實驗設計也相當重要。在這個環(huán)節(jié)，我們需要對消化方案、抗體標記策略、熒光配色方案等等做初步規(guī)劃，并在預實驗中逐步完善，最終在正式實驗中獲得預期的數(shù)據(jù)結果。
本期，我們主要關注實驗設計中的熒光配色。但在正式討論熒光配色前，我們先來聊一聊流式分析儀的基本原理，相信這會對我們后續(xù)更好地運用熒光配色有所幫助。
02、流式分析儀的基本原理
流式分析儀的識別過程可以簡單分為【光信號】→【電信號】→【數(shù)字信號】→【輸出】。具體過程如下：
流式細胞術原理圖
1. 光信號的接收識別
分析儀中的光路系統(tǒng)通過激光束照射流動通過的單細胞懸液，產(chǎn)生不同的光信號，其中包括無需激發(fā)的物理參數(shù)信號（FSC、SSC）和需要一定能量的激光束激發(fā)的熒光信號。沒有照射到細胞的激光束，向前直射形成前向散射光信號（FSC），因此在一定范圍內(nèi)，F(xiàn)SC與細胞的大小正相關；接觸細胞的激光束，產(chǎn)生不同的折射光信號，包括側向散射光信號（SSC）、熒光信號。細胞內(nèi)的復雜程度越高，折射的SSC信號就越強，因此在一定范圍內(nèi)，SSC與細胞內(nèi)的復雜程度成正比。同時，由于SSC信號一般較弱，熒光信號通常能夠從折射光信號中分離出來，再經(jīng)過不同的濾光片分離，從而被特定的接收器（通道）接收。
2. 光信號的轉(zhuǎn)換輸出
接下來，光電二極管（用于FSC）、光電倍增管（用于SSC、熒光信號）會將【光信號】轉(zhuǎn)換成【電信號】，并最終轉(zhuǎn)換成【數(shù)字信號】在圖形界面【輸出】，到此我們就能夠直觀地看到我們所需要的流式圖了。
多色流式分析示例圖（小鼠肺實質(zhì)細胞群中MO/MΦ/DC相關亞群的參考圈門策略）
因此，如何讓流式分析儀獲取足夠強度并且準確的光信號，是獲得優(yōu)質(zhì)流式數(shù)據(jù)的關鍵。在這里，有兩個關鍵指標：準確性、強度，將成為我們設計熒光配色方案的衡量標準。
03、熒光配色方案之準確性指標
準確性：即如何讓熒光信號和諧共處、各自安好地被識別。一般在閱讀了大量文獻的基礎上（新手上路的默認必須操作，老司機也請注意行車規(guī)范），我們會確定在單一樣品中需要標記的不同marker。主要分為以下幾個步驟：
1. 找到在流式分析儀上可識別的熒光素
通常我們會用不同熒光素標記的抗體來結合marker，因此可用的熒光素有數(shù)量、種類上的限制。
1） 數(shù)量：受到分析儀接收器（通道）的限制，以BD LSRFortessa（以下簡稱Fortessa）為例，選配為5激光18通道，因此單管樣品染色的熒光素【數(shù)量】上限為18。
2） 種類：受到激光管波長、濾光片2個因素的限制。以BD FACSCalibur（以下簡稱Calibur）為例，選配為2激光（488nm、635nm）4通道。受到激光管波長的限制，以355nm、405nm激發(fā)的熒光素（BUV375、BV421等）并不能在Calibur上應用；受到濾光片的限制， PerCP與PE-Cy7在Calibur上均為488nm激發(fā)，均被FL3（670LP）識別接收，不能同時適用。但在Fortessa上能夠二者能分別被488nm、561nm激發(fā)，分別被FL2（710/50nm）、FL7（780/60nm）識別接收，能夠同時適用。
2. 在可用的熒光素中，找出能夠和諧共處、各自安好的組合。
流式分析儀識別的熒光信號，一部分來源于激光激發(fā)細胞本身蛋白產(chǎn)生的熒光信號，我們稱之為“自發(fā)熒光”，另一部分來源于結合到細胞上的抗體耦聯(lián)的熒光素被激光激發(fā)后產(chǎn)生的信號。
在選用熒光素的時候，首先要盡量避開自發(fā)熒光的發(fā)射光譜范圍，避免自發(fā)熒光對目標熒光信號的干擾。其次，我們要盡可能地基于“熒光素強度”、“相互干擾程度”兩方面和諧共處的原則來選用熒光素。
舉例：以5色標記，F(xiàn)ortessa為例
組合1：PE、PE-eFluor610、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7
組合2：BV421、FITC、PE、PE-Cy7、APC
一般我們可能習慣于根據(jù)“熒光素強度”從高到低開始翻牌，但是對于多色流式而言，熒光素之間發(fā)射光譜的“相互干擾程度”非常關鍵，輕視它的后果就是會在補償調(diào)節(jié)的時候讓你調(diào)到懷疑人生。
組合1是一個極端配色方案（相信一般人不會想去挑戰(zhàn)這個補償調(diào)節(jié)），這是一組PE和PE耦聯(lián)熒光素的組合，在Fortessa上這個組合均由561nm激發(fā)，被范圍接近的濾光片分離，并被接收識別。雖然各自的“熒光素強度”足夠，但是由于在561nm 的激發(fā)下，它們的發(fā)生光譜有明顯的交叉重疊區(qū)域（如圖所示），即它們之間的“相互干擾程度”很高，這會讓補償調(diào)節(jié)變得相當困難，進而導致信號失真的可能性增大。這個時候，我們會選擇在可接受的范圍內(nèi)犧牲“熒光素強度”。例如選用熒光強度不那么強的FITC、APC-Cy7等來避開難以調(diào)節(jié)的補償參數(shù)，組合2就在一定程度上，兼顧了“熒光素強度”和“相互干擾程度”。
在561nm激發(fā)下，組合1的發(fā)射光譜分析
www.bdbiosciences.com/en-us/applications/research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer
04、熒光配色方案之強度指標
強度：即在滿足準確性的熒光素組合內(nèi)，通過熒光素的分配，讓我們所有希望了解的marker，都能刷出存在感。在這里給大家2個經(jīng)驗之談，大神勿噴。
1. 高低搭配，出圖不累。
我們可以將光信號強度理解為【marker豐度×熒光素強度】，因此對于低豐度的marker，我們要拉一把，配一個高強度的熒光素。例如，目標細胞群體為小鼠來源的pDC（漿樣DC），部分marker為Siglec-HloF4/80mid，配色為PE（強）、APC-Cy7（弱），考慮的配色方案為，Siglec-H-PE、F4/80-APC-Cy7。此外，對于低豐度的marker，直接利用陽性群進行補償調(diào)節(jié)可能會引起信號失真，因此可以考慮采用Compbead捕獲抗體或者采用高豐度marker搭配耦聯(lián)同樣熒光素的抗體進行近似調(diào)節(jié)。
2. 同一層面，補償走開。
在多色流式分析的過程中，我們通常會設置多個邏輯層和門。在同一層次的邏輯設門中，可以考慮避開那些八字不合補償難以調(diào)節(jié)的熒光配對。例如，層次1（F4/80、Ly-6G）→層次2（CD11b、CD11c），配色為eFluor 450、PE-eFluor 610、FITC、PE。個人考慮的配色方案中，PE與PE-eFluor 610不放在同一邏輯層，采用F4/80-PE-eFluor 610，Ly-6G-eFluor 450，CD11b-FITC，CD11c-PE。如果有童鞋感興趣，可以嘗試把PE、PE-eFluor 610湊對，就會發(fā)現(xiàn)存在對角線尖峰，若通過補償調(diào)節(jié)將尖峰調(diào)沒，可能會補償過度，從而導致一些細胞亞群的信號失真，得不償失。
05、總 結
熒光配色的目的，是為了讓流式分析儀能夠“準確”地識別足夠“強度”的熒光信號。
▲ 從準確性出發(fā)，我們要根據(jù)硬件限制（激光管、通道數(shù)、濾光片）選出可用熒光素，在可用熒光素中，根據(jù)“熒光素強度”、“相互干擾程度”、“自發(fā)熒光”等選出較優(yōu)的配色組合。
▲ 從強度出發(fā)，我們要讓每一個目標marker都能獲得足夠被識別的熒光強度信號，因此要根據(jù)“高低搭配”、“邏輯設門”等來作出最終的熒光分配方案。
