ES細胞打靶技術介紹

你聽說過喀邁拉獸（chimera）嗎？沒錯，就是古希臘神話故事中一只會噴火的怪獸，這種怪獸擁有獅頭、羊身、蛇尾，像是由幾種動物拼成的。

或許你知道喀邁拉獸，但你是否知道在生物遺傳學中也有一種名為喀邁拉的動物嗎？那這神奇的怪獸與我們生物領域中的ES細胞基因打靶到底有什么關系呢？本期話題，咱們就一起來聊聊遺傳學中的chimera。

圖1. 希臘神話中的喀邁拉獸（左）和現(xiàn)代生物遺傳學中的 “Chimera”（右）

Chimera在生物學中是一種很常見的現(xiàn)象，一般可以理解為嵌合體，如怪獸是由不同動物組成，在生物中如上圖的老鼠，就是ES細胞打靶技術得到的chimera小鼠。

之所以這里談論ES細胞，是因為這項技術已經廣泛應用于基因功能和基礎理論的研究、疾病模型的建立、基因治療和優(yōu)質育種等。小編現(xiàn)在就帶著大家一步步走入ES細胞這個神奇的世界，把此技術的原理及實驗技巧等心得毫無保留地分享給大家。

ES細胞打靶的原理

胚胎干細胞( Embryonic Stem Cell, ESC )是在胚胎植入子宮前，從囊胚狀態(tài)的胚胎的內細胞團（Inner cell mass, ICM）分離出來的一群多能干細胞，理論上可分化為任意的體細胞。

基因打靶技術即建立在ES細胞與DNA同源重組等技術基礎上的分子生物學技術。利用同源重組技術對ES細胞特定位點的基因進行改造，通過顯微注射或者胚胎融合的方法將經過遺傳修飾的ES細胞引入受體胚胎內。遺傳修飾的ES細胞仍然保持分化的全能性，可以發(fā)育為嵌合體動物的生殖細胞，使得修飾的遺傳信息經生殖系遺傳。尤其是近幾年CRISPR/Cas9掀起的基因編輯浪潮，極大地催化了ES細胞基因打靶技術的步伐，豐富了科研人員對人類疾病和相關基因功能的了解。（圖2）

圖2.CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯

ES細胞打靶的實驗步驟：

1. ES細胞擴增至合適密度，消化并進行細胞計數(shù)。為提高電轉效率，用1xDPBS重懸細胞沉淀；

2. 細胞計數(shù)后取5x106細胞懸液至滅菌1.5ml EP管中，并加入sgRNA（10μg）和Cas9（10μg）表達質粒、Donor質粒（15μg），混合均勻，并將體積用1XDPBS補至800μl，后將液體轉移至潔凈電轉杯（Bio-Rad, 4mm）中；

3. 電轉儀進行電轉，電轉后向電轉杯中加500μl預熱ES medium，用槍輕輕吹勻并小心吸出液體，加入預先準備ES medium的10cm皿中，搖勻培養(yǎng)；

4. 24h后吸出舊的培養(yǎng)基，1XDPBS清洗細胞碎片，后加入8ml新鮮ES培養(yǎng)急基；

5. 48h后加puromycin（濃度為1.2—3.0μg/ml）進行篩選；

6. 每天換液，約篩選6天開始挑取單克隆至48孔板中；

7. 待7—9天克隆長起來后將其分別傳代至24孔板中擴大培養(yǎng)；

8. 約2—3天克隆成功擴增后每個孔取3/4細胞進行基因型鑒定，1/4細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)；

9. 基因型鑒定完成后，即可根據(jù)細胞培養(yǎng)狀態(tài)安排胚胎囊胚注射實驗，并將注射后的胚胎移植到假孕母鼠體內；

10. 待小鼠出生后鑒定子代嵌合體（chimera）形成情況，并通過子代嵌合體小鼠的交配繁殖獲得能穩(wěn)定遺傳的小鼠。

圖3. 利用ES細胞打靶獲得基因編輯小鼠過程

注意細節(jié)：

1. ES細胞擴增培養(yǎng)階段確保細胞質量，若細胞狀態(tài)不佳可將細胞傳一代后再培養(yǎng)；

2. ES細胞培養(yǎng)及電轉過程中應確保環(huán)境潔凈無污染，否則將導致細胞污染死亡；

3. 電轉時細胞數(shù)量不少于4x106，細胞數(shù)量太少導致電轉后存活的細胞極少，影響陽性克隆篩選；

4. 挑取單克隆前為保證環(huán)境條件良好，UV（紫外線）照射時間不少于2小時；

5. ES細胞囊胚注射對細胞質量要求較高，因此盡量選用代數(shù)靠前且狀態(tài)較好的細胞株進行囊胚注射。

總之，胚胎干細胞培養(yǎng)需要更嚴格的環(huán)境，培養(yǎng)過程中一定要保證細胞不分化、不污染。在進行電轉試驗后應每天觀察細胞狀態(tài)，及時更換新鮮培養(yǎng)基，使ES細胞始終保持良好的生長狀態(tài)。（關于ES細胞顯微注射和基因型鑒定等技巧，我們會后續(xù)介紹，期待您繼續(xù)關注我們動態(tài)。）

近10年來生命科學領域都有利用ES細胞基因打靶技術新建立各種疾病模型，為疾病機理研究、新藥研發(fā)和治療方案評價提供了寶貴的資源。早已經是一項生物分子學領域筒子們必備的技能。

或許希臘神話中的喀邁拉獸（chimera）不大可能會中成為實現(xiàn)，但利用ES細胞基因打靶產生的嵌合體（chimera）會為人類認識自我本質，攻克重大疾病提供不可或缺的資源。就讓我們拭目以待吧！

這項技能您get到了嗎？如果您有更好的建議或者想了解更多的實驗技巧，可以關注我們公眾號，給我們留言哦！我們期待您的參與！