凝集素芯片技術(shù)應(yīng)用于腫瘤侵襲研究

 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移與糖鏈的表達(dá)密切相關(guān)。一些腫瘤細(xì)胞糖基化修飾的改變能夠影響細(xì)胞的周期調(diào)控和細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，但具體分子機(jī)制尚不清晰。來(lái)自美國(guó)紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科研小組借助糖基化研究新工具——凝集素芯片，發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)驅(qū)動(dòng)因子，進(jìn)而找到其上游調(diào)控因子以及下游靶向因子，揭開(kāi)了黑色素瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，相關(guān)結(jié)果發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊Cancer cell上（PMID: 28609658）。

 
技術(shù)背景——凝集素芯片介紹

凝集素（Lectin）是一類(lèi)自然界廣泛存在的蛋白質(zhì)，具有特定糖結(jié)構(gòu)識(shí)別的特性。利用凝集素進(jìn)行特定糖結(jié)構(gòu)的解析是糖生物學(xué)研究領(lǐng)域的常用手段。凝集素芯片是將多種經(jīng)典凝集素以微陣列的形式固定在高分子三維芯片片基上，形成高通量凝集素芯片，可進(jìn)行多種糖結(jié)構(gòu)的同步篩選和交叉驗(yàn)證。

1、凝集素芯片篩選糖基化譜

首先，研究人員通過(guò)凝集素芯片對(duì)臨床黑色素瘤樣本進(jìn)行差異糖蛋白篩選。重點(diǎn)分析黑色素瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中糖基化差異，找到了發(fā)生顯著變化的四種糖基化修飾（綠色方框表示該糖基化在原發(fā)灶中高表達(dá)，轉(zhuǎn)移灶中低表達(dá)；紅色方框表示該糖基化在原發(fā)灶中低表達(dá)，轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)。同時(shí)，研究人員從TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取獲得相對(duì)應(yīng)的糖基化基因的表達(dá)水平數(shù)據(jù)，見(jiàn)圖1。（PS: TCGA (The cancer genome atlas)是目前重要的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，其主要收錄各種人類(lèi)癌癥的臨床數(shù)據(jù)，基因組變異，mRNA表達(dá)，miRNA表達(dá)，甲基化等數(shù)據(jù)，是癌癥研究者很重要的數(shù)據(jù)來(lái)源。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus)是NCBI的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，也是當(dāng)今比較全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源。）
 

圖1 黑色素瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中糖基化檢測(cè)與糖基因表達(dá)水平分析

 

2、體外實(shí)驗(yàn)：糖基化基因功能驗(yàn)證
        隨后，科研人員在黑色素瘤細(xì)胞系中，應(yīng)用siRNA技術(shù)對(duì)先前篩到的差異糖基化基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)FUT1、FUT2的沉默促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，而抑制FUT8后，腫瘤轉(zhuǎn)移明顯下降。免疫熒光和免疫組化結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)移灶中凝集素LCH等識(shí)別的N核心巖藻糖基化（糖基化基因?yàn)镕UT8）表達(dá)明顯升高，而凝集素UEA-I等識(shí)別的α-1,2巖藻糖基化（糖基化基因?yàn)镕UT1/ FUT2）表達(dá)顯著降低，見(jiàn)圖2。
 

圖2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證糖基化基因功能

 
3、體外&體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：糖基化基因FUT8功能確證
        對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)來(lái)說(shuō)，在轉(zhuǎn)移灶中上調(diào)的指標(biāo)FUT8相對(duì)更容易作為藥物靶點(diǎn)。因此，研究人員后續(xù)重點(diǎn)關(guān)注FUT8，推測(cè)FUT8可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)子。進(jìn)一步，通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲減FUT8，細(xì)胞侵襲受到抑制，黑色素瘤體內(nèi)侵襲能力也有明顯下調(diào)，證實(shí)FUT8的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)，如圖3。
 

圖3 糖基化基因FUT8功能確證

4、FUT8上下游轉(zhuǎn)移機(jī)制研究
        研究人員采用Matinspector software轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件結(jié)合ChIP Enrichment Analysis database找了一系列FUT8上游轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò)siRNA實(shí)驗(yàn)，證實(shí)TGIF2作為上游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控FUT8的表達(dá)，見(jiàn)圖4。
 

圖4 FUT8上游調(diào)控因子分析

研究人員選取3株不同的黑色素瘤細(xì)胞系，通過(guò)核心巖藻糖凝集素pull-down結(jié)合MS鑒定，鑒定到三個(gè)樣本中共同擁有的114種巖藻糖基化修飾的蛋白。進(jìn)一步進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)一系列與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移相關(guān)的蛋白，如L1CAM、NRP2，見(jiàn)圖5。
 

圖5 FUT8下游靶向控因子分析

 
5. FUT8靶向L1CAM 促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲

根據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道，L1CAM與黑色素瘤發(fā)展密切相關(guān)，因此研究人員推測(cè)FUT8可能通過(guò)促進(jìn)L1CAM的巖藻糖基化來(lái)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在過(guò)表達(dá)L1CAM的腫瘤細(xì)胞中敲減FUT8，L1CAM核心巖藻糖基化程度下降，侵襲能力下降；過(guò)表達(dá)FUT8，敲減L1CAM可以明顯抑制腫瘤侵襲。L1CAM的N核心巖藻糖基化可以保護(hù)其不被蛋白酶識(shí)別剪切，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如圖6。
 

圖6 FUT8靶向L1CAM促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲

 

小結(jié)：

在這項(xiàng)研究中，研究人員應(yīng)用凝集素芯片，找到黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)的4種糖基化修飾類(lèi)型。進(jìn)一步根據(jù)差異糖基化尋找糖基化差異基因，發(fā)現(xiàn)FUT8參與黑色素瘤轉(zhuǎn)移。TGIF2調(diào)節(jié)FUT8的轉(zhuǎn)錄促使在轉(zhuǎn)移灶中的高表達(dá)，而FUT8介導(dǎo)L1CAM的N核心巖藻糖基化水平上升，導(dǎo)致plasmin無(wú)法識(shí)別L1CAM，失去對(duì)L1CAM的水解作用，而全長(zhǎng)的L1CAM可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，如圖7。關(guān)于凝集素芯片，我們經(jīng)�？吹降膱�(bào)道都是疾病標(biāo)志物相關(guān)的研究。本文通過(guò)凝集素芯片進(jìn)行深入的腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究，說(shuō)明了糖基化基因可以成為驅(qū)動(dòng)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的癌基因，為腫瘤及其他疾病深入機(jī)理探索提供了新的切入點(diǎn)和研究思路，值得推薦。
 

圖7  FUT8促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲模式圖

華盈生物作為中國(guó)蛋白芯片行業(yè)的標(biāo)桿企業(yè)，我們著力打造蛋白芯片全產(chǎn)品線和系統(tǒng)性解決方案。我們提供的凝集素芯片覆蓋有55種常見(jiàn)凝集素，能夠?yàn)榧膊�機(jī)理研究、疾病標(biāo)志物研究、糖修飾組研究等提供強(qiáng)大技術(shù)支撐。

凝集素芯片產(chǎn)品信息詳見(jiàn)官網(wǎng)：http://www.wayenbio.com/11-205057-75393-item-321298.html

 
英文文獻(xiàn)鏈接：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28609658