蛋白純化FAQs

蛋白純化FAQs​

Q1：在大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中，可以從細(xì)胞裂解物的可溶性部分或不可溶性部分純化蛋白質(zhì)嗎？

A1：我們可以從兩個(gè)組分中純化蛋白質(zhì)。它將取決于客戶的實(shí)驗(yàn)需求或。我們的科學(xué)家在蛋白質(zhì)復(fù)性方面有很好的經(jīng)驗(yàn)。選擇特定的復(fù)性策略是基于蛋白質(zhì)的序列及其結(jié)構(gòu)特性。

Q2：如果使用親和標(biāo)簽，是否可以在純化后把它從蛋白質(zhì)中切割出來(lái)？

A2：是的，我們使用可以在純化后被切割下來(lái)并從純化的蛋白質(zhì)中去除的標(biāo)簽（例如，通過(guò)在基因合成過(guò)程中引入凝血酶或TEV蛋白酶切割序列-一些氨基酸可能在切割后留在蛋白質(zhì)上）。

Q3: 固定化抗體后，第一次親和純化蛋白效果良好，但在第二輪純化過(guò)程中蛋白未能與抗體結(jié)合，是什么原因？

A3: 低pH洗脫是親和純化最常用的洗脫方法，但它可能導(dǎo)致某些抗體變性，從而對(duì)隨后的抗原結(jié)合產(chǎn)生負(fù)面影響。為了防止這種情況發(fā)生，在蛋白質(zhì)純化之后，立即用中和或結(jié)合緩沖液洗滌柱子，并將其儲(chǔ)存在含有抗菌劑如疊氮鈉的緩沖液中，溫度為4℃�；蛘撸�使用近中性，高鹽洗脫緩沖液，如Pierce Gentle Ag/Ab Elution Buffer。

Q4: 純化具有半胱氨酸的抗體,應(yīng)該用什么辦法呢？

A4: Sulfolink偶聯(lián)樹(shù)脂（SulfoLink Coupling Resin）或超臨界碘乙醛樹(shù)脂（UltraLink Iodoacetyl Resin）將是不錯(cuò)的選擇，它們利用相同的化學(xué)反應(yīng)與還原的硫醇基團(tuán)反應(yīng)。

Q5: 生物素親和純化是如何實(shí)現(xiàn)的？

A5: 固定化親和素、鏈霉親和素或中性親和素用于純化生物素裂解分子。這些分子與生物素的高親和力要求不可逆變性以釋放生物素本身(包括在SDS-PAGE樣品緩沖液或8M胍、pH 1.5中沸騰)。

Q6: 能提供一些關(guān)于蛋白純化后蛋白再折疊的建議嗎？

A6: 請(qǐng)閱讀下面的建議：

*保持低蛋白濃度10-50μg/ml。

*二硫鍵有助于穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)；添加氧化還原對(duì)，如GSH（還原型谷胱甘肽）。

*GSSG（氧化型谷胱甘肽），其比為10:1，GSH濃度為2-5mm。這種氧化還原對(duì)有助于在折疊過(guò)程中產(chǎn)生破壞和建立新的S-S鍵的氧化電位。

*通過(guò)稀釋或透析緩慢去除變性劑；甘氨酸(50mM，pH 9.0，5mM EDTA)有助于溶解蛋白質(zhì)。如果使用GuHCl（鹽酸胍），加入2M尿素，因?yàn)槟蛩匾灿兄�于穩(wěn)定蛋白質(zhì)折疊。

*在非常低的濃度下添加洗滌劑，例如0.1-0.5%的NP40或0.005%（V/V）Tween 20。

*包括用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的共溶劑，如甘油（5-20%）或PEG 8000或葡萄糖或蔗糖（10%）。

*某些陰離子(例如，磷酸鹽或硫酸鹽)或陽(yáng)離子(例如，MES或HEPES)也具有積極作用；包括鹽并保持中性pH，例如100mM KCl，或150-500mM NaCl，2mM MgCl₂。

*通過(guò)添加蛋白酶抑制劑，如0.5mM PMSF、0.005-2g/mL抑肽酶、2g/mL抑肽酶或2-5g/mL亮肽素來(lái)避免蛋白質(zhì)降解。

*磷酸鹽緩沖液在抗鈣時(shí)透析將導(dǎo)致磷酸鈣沉淀。如果隨后的腸激酶消化需要CaCl₂（10mM Tris pH 8，10mM CaCl₂），記得在透析完成后加入CaCl₂。

Q7: 使用相同的親和柱可以執(zhí)行多少次純化？

A7: 這隨著固定化蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和所用洗脫緩沖液的類型而變化，通�？梢灾貜�(fù)使用色譜柱至少10次而不會(huì)顯著損失活性。