【干貨】流式細(xì)胞術(shù)原理與應(yīng)用詳解
流式細(xì)胞術(shù)
流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù)。其特點(diǎn)是:第一，只要樣本制備成單個細(xì)胞或生物顆粒懸液均可以分析。第二，測量速度快，每秒中可以測量數(shù)千個乃至數(shù)萬個細(xì)胞。第三，同時測量每個細(xì)胞的多參數(shù)特征。第四，在進(jìn)行細(xì)胞特征分析的同時可以把指定特征的細(xì)胞分離出來，以便對特定細(xì)胞做進(jìn)一步培養(yǎng)、克隆化、觀察或進(jìn)行某些實(shí)驗(yàn)，這就是分選技術(shù)。
那么，具體是如何通過FCM實(shí)現(xiàn)分選的呢？
1、首先，制備單細(xì)胞懸液
將待測細(xì)胞或微粒制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，在恒定氣體的壓力下進(jìn)入流動室，不含細(xì)胞或微粒的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流形成一定角度，鞘液包繞著樣品高速流動，組成一個圓柱形的液流束，待測細(xì)胞或微粒在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。
2、其次，收集單細(xì)胞上的熒光信號
流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，細(xì)胞或微粒上的熒光染料被激發(fā)，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測，這種信號基本上反映了細(xì)胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。
3、再次，統(tǒng)計結(jié)果
熒光信號的強(qiáng)度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原強(qiáng)度或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電轉(zhuǎn)換變?yōu)榭杀挥嬎銠C(jī)識別的數(shù)字信號。計算機(jī)把所測量到的各種信號進(jìn)行計算機(jī)處理，將分析結(jié)果顯示在計算機(jī)上。
4、最后，做細(xì)胞分選
細(xì)胞的分選是指根據(jù)所測定的各個參數(shù)將指定的細(xì)胞從細(xì)胞群體中分離出來的一種方式，通過分離含有單細(xì)胞的液滴實(shí)現(xiàn)。在流動室的噴口上方配有一個超高頻的壓電晶體，產(chǎn)生的振動使噴出的液流形成均勻的液滴，待測細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離[1]。
流式細(xì)胞術(shù)動用了現(xiàn)代多科高技術(shù)，能夠同時定量檢測檢測單個細(xì)胞的多項(xiàng)指示，顯示出無比優(yōu)越性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)研究、海洋生物以及分選應(yīng)用等研究領(lǐng)域。
這么高級的單細(xì)胞統(tǒng)計儀器，到底能做哪些實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/strong>
比如，細(xì)胞計數(shù)標(biāo)記可以幫助分析細(xì)胞，我們以此為例說明流式細(xì)胞儀的應(yīng)用。
圖2、流式檢測B-NDG小鼠血液和脾臟細(xì)胞中NK細(xì)胞比例
如圖，一個點(diǎn)表示一個細(xì)胞，縱坐標(biāo)表示熒光散射，將細(xì)胞分散開；橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，結(jié)合的抗體越多，表達(dá)的NKp46越多，說明該表達(dá)Nkp46的細(xì)胞群為NK細(xì)胞。結(jié)果顯示： 在C57BL/6小鼠的脾臟和血液中均可檢測到NKp46的表達(dá)；在B-NDG小鼠中未檢測到NKp46的表達(dá)，表明B-NDG小鼠中沒有NK細(xì)胞。
T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的檢測
圖3、B-NDG®小鼠的T 、B和NK細(xì)胞的完全缺失[3]
取BALB/c、NOD-scid和B-NDG小鼠的外周血細(xì)胞，并通過流式對比其中T 、B和NK細(xì)胞的組成（A）并進(jìn)行統(tǒng)計對比（B）。圖3A橫坐標(biāo)/縱坐標(biāo)都表示熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，抗體表達(dá)量越多，則表達(dá)這些marker的相應(yīng)細(xì)胞存在。B-NDG小鼠CD3、CD19和NKp46的相對應(yīng)區(qū)域沒有熒光，說明B-NDG小鼠中表達(dá)CD3、CD19和NKp46的成熟T,B和NK細(xì)胞不存在。結(jié)果：B-NDG®小鼠外周血中缺乏成熟的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。
好了，今天就到這里了，這些只是基本的流式細(xì)胞儀的分析原理和使用，流式細(xì)胞儀的使用可以更深更廣，想了解更多相關(guān)知識，請繼續(xù)關(guān)注我們吧！
參考資料：
[1]《流式細(xì)胞術(shù)原理與應(yīng)用教程》
[2]http://www.flowlab-childrens-harvard.com/new_user
[3]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/52.html
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