淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗方法介紹

      T細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，此稱為淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可以反映機體的細胞免疫水平，因此，可作為測定機體免疫功能的指標(biāo)之一。
     本實驗采用形態(tài)學(xué)方法進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。T淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中受有絲分裂原如植物血凝素刺激后，轉(zhuǎn)化為體積較大的母細胞，胞漿增多而深染，核增大并可見核仁裂，計數(shù)轉(zhuǎn)化細胞的百分率可反映機體的細胞免疫功能。
【材料】
1．RPMLl640培養(yǎng)液(用前調(diào)至含小牛血清10％、青霉素100u／m1、鏈霉素μg/m1，用NaHCO3調(diào)pH至7.2-7.4)。
2．PHA(用RPMIl 640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配成1000μg／m1)。
3．吉姆薩染液。
4．離心機、恒溫箱、計數(shù)器及顯微鏡等。
【方法】
1. 取無菌肝素抗凝血0.1m1，加入1.8m1細胞培養(yǎng)液中，同時加入PHA0.1m1，對照管不加PHA，將細胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)3天，每天搖動1次。
2. 2500r／min，離心10min后棄上清液，留0.2m1沉淀細胞制片，迅速吹干。
3. 吉姆薩染色10一20min，水洗，干燥。
4. 油鏡計數(shù)200個淋巴細胞中轉(zhuǎn)化的細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)化率。
【結(jié)果觀察】
1．淋巴母細胞的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是細胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性及核的構(gòu)造與
核仁的有無�？梢砸姷揭韵聨追N類型細胞。
(1)成熟的小淋巴細胞：與未經(jīng)培養(yǎng)的小淋巴細胞一樣為6-8μm，核染色致密，無核仁，核與胞漿比例大，胞漿染色為輕度嗜堿性。
(2)過渡型淋巴細胞：比小淋巴細胞大，約l0-20μm，核染色致密，但出現(xiàn)核仁，此為與成熟小淋巴細胞鑒別要點。
(3)淋巴母細胞：細胞體積增大，約20-30μm，形態(tài)不整齊，常有小突出，核質(zhì)染色疏松，有核仁l-2個，胞漿變寬，常出現(xiàn)胞漿空泡。
(4)其它細胞：如中性粒細胞在培養(yǎng)72h后，絕大部分衰變或死亡，呈碎片。
2．淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的計算：按上述分類檢查推片頭、體、尾三部分，計數(shù)200個淋巴細胞，計算過度型和淋巴母細胞百分率。在正常情況下，PHA誘導(dǎo)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率為60％一80％，如為50％一60％則偏低，50％以下則為降低。
【注意事項】
1．培養(yǎng)基成分對轉(zhuǎn)化率影響較大，注意其有效期。
2．小牛血清用前需滅活。
3．培養(yǎng)時要保證有足夠的氣體，
4．PHA劑量過大對細胞有毒性，PHA轉(zhuǎn)化反應(yīng)劑量一般10m1，培養(yǎng)瓶內(nèi)液體總量不要超過2m1，太小不足以刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化，試驗前應(yīng)先測定。