血液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

血液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

血液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH PX）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用比色法來(lái)測(cè)定血液樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種血液樣品（動(dòng)物、人體等）包括血漿和血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase；GSH PX或GPX；EC 1.11.1.9）屬于硒蛋白（Selenoprotein）家屬成員之一，在細(xì)胞漿和線粒體組分中表達(dá)，其功能在于催化各種過(guò)氧化物的還原，包括氫過(guò)氧化物、過(guò)氧化氫等，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害。酶活的降低與巴金森氏、慢性腎小球腎炎（glomerulonephritis）等疾病有關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，存在四種類(lèi)型的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶：I型為經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)型；II型為胃腸道型；III型為血漿型；IV型為磷脂氫過(guò)氧化代謝型（phospholipid hydroperoxide metabolizing）。除IV型（為單體）外，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的結(jié)構(gòu)為同源四體，每個(gè)單體為22至23kd，其活性結(jié)構(gòu)域含有硒代半胱氨酸（selenocysteine）�；�于谷胱甘肽過(guò)氧化物酶催化有機(jī)過(guò)氧化物（ROOH）的還原，同時(shí)使還原型谷胱甘肽（reduced glutathione；GSH）氧化成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione； GSSG）；進(jìn)而在谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase；GR）的作用下，氧化型谷胱甘肽被還原成還原型谷胱甘肽，同時(shí)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP），根據(jù)其氧化后峰值的降低（340nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的總活性。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶偶聯(lián)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）  毫升

底色液（Reagent B）  毫升

反應(yīng)液（Reagent C）    毫升

陰性液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存底色液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

選擇二：血清樣品

• 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲(chǔ)存管 
• 抽取1毫升血液，置于儲(chǔ)存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 測(cè)定準(zhǔn)備
• 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent B）避免光照
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
• 背景對(duì)照測(cè)定
• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升底色液（Reagent B）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）
• 樣品測(cè)定
• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升底色液（Reagent B）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)） 

五、計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)板測(cè)定
• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）到96孔板中
• 分別加入xx微升底色液（Reagent B）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent D）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標(biāo)板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 檢測(cè)敏感范圍為5至30毫單位/毫升
• 待測(cè)樣本避免含有還原劑（DTT和巰基乙醇）以及某些去垢劑（TWEEN-20、TRITON X-100）等，干擾檢測(cè)
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 背景空對(duì)照0秒讀數(shù)通常0.2至0.8為理想狀態(tài)
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感