多肽純化十問(wèn)十答

  小編曾在本公眾號(hào)發(fā)布過(guò)一篇文章題為《大有講究的“小型蛋白”純化》，其后有諸多研究多肽藥物純化的讀者對(duì)這方面的分離純化頗感興趣，紛紛來(lái)電交流探討。小編特結(jié)合網(wǎng)絡(luò)資料和實(shí)踐整理出了多肽純化的十個(gè)問(wèn)答題分享給大家，希望各位能夠喜歡。

1. 多肽含量與多肽純度有什么區(qū)別？
一條多肽產(chǎn)品中除了多肽本身還包括生產(chǎn)過(guò)程中帶入的水份及有機(jī)鹽分等雜質(zhì)，多肽純度僅指多肽本身所含肽產(chǎn)品的含量及雜質(zhì)的含量，不包括水份等雜質(zhì)；而多肽含量則是指目標(biāo)多肽在產(chǎn)品中的凈含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來(lái)檢測(cè)；因此一條多肽即使純度達(dá)到99%，因?yàn)楫a(chǎn)品中還包含水份及有機(jī)鹽分等，它的含量可能也只有70-80%。

2 如何溶解多肽？多肽樣品在上制備柱前為什么需要進(jìn)行前處理？有哪些前處理的方法？
多數(shù)多肽都可以用超純水溶解，對(duì)于一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對(duì)于酸性多肽，可先以小量堿性（如0.1%氨水）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于堿性多肽，可先以小量酸性（如醋酸，三氟乙酸）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于疏水性多肽，可用強(qiáng)極性有機(jī)溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。制備色譜柱子由于處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，因此有必要對(duì)樣品進(jìn)行前處理以有效延長(zhǎng)制備柱的壽命。主要方法有5種：萃取、過(guò)濾、離心、上預(yù)柱、加在線過(guò)濾器。

3. 為什么流動(dòng)相中要加入三氟乙酸作為離子對(duì)試劑，還有哪些流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑可用于多肽的分離純化？
目前常用的流動(dòng)相體系是水加乙腈，以三氟乙酸（TFA）為離子對(duì)試劑，根據(jù)不同多肽以合適的梯度洗脫分離多肽。加入三氟乙酸能調(diào)節(jié)洗脫液的PH，同時(shí)作為離子對(duì)試劑與多肽相互作用，從而增強(qiáng)分離效果，明顯改善峰形。其它可用于多肽分離純化的流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑包括醋酸體系，磷酸體系，鹽酸體系，七氟丁酸等通過(guò)適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)PH都能取得很好的分離效果。

4. 如何選擇純化過(guò)程中使用的色譜柱填料？
不同序列的多肽理化性質(zhì)及疏水性有很大的區(qū)別，多數(shù)情況分子量小于4000和親水性多肽用C18柱分離效果最佳，分子量大于5000和極端疏水性的多肽以C4柱分離效果最佳，而C8柱介于C18和C4柱之間，其應(yīng)用效果與C18柱更相似；對(duì)一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱和聚合物色譜柱。

5. 在純化過(guò)程中選擇聚合物填料的原則是什么？
需要使用高于正常pH或溫度條件進(jìn)行純化時(shí)，可以使用pH范圍極寬的聚合物色譜柱，它的優(yōu)點(diǎn)就是在極端pH條件下不會(huì)降解，可以使用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿作為流動(dòng)相進(jìn)行分離純化。

6. 影響多肽純度檢測(cè)結(jié)果的因素
影響多肽純度檢測(cè)結(jié)果的因素很多，主要包括：流動(dòng)相體系、色譜柱型號(hào)、柱溫、波長(zhǎng)及色譜儀的性能指標(biāo)，每一項(xiàng)不同都可能造成結(jié)果產(chǎn)生誤差。

7. 在多肽檢測(cè)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)基線漂移的原因是什么？怎么解決？
固定三氟乙酸濃度的梯度洗脫有時(shí)會(huì)在210-220nm檢測(cè)處造成吸收基線的漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。降低或消除由于三氟乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測(cè)波長(zhǎng)靠近215nm，并在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三氟乙酸補(bǔ)償基線漂移。例如溶劑A中的三氟乙酸為0.1%時(shí)，溶劑B中可用0.085%。

8. 反相色譜分離純化后，怎樣去除產(chǎn)品中流動(dòng)相產(chǎn)品中的TFA，乙腈等雜質(zhì)？
凍干的辦法應(yīng)該可以除去大多數(shù)TFA和乙腈，只要不超過(guò)允許范圍，這種辦法是最簡(jiǎn)單、有效的。對(duì)TFA含量要求更高的一些藥物肽凍干的方法一般無(wú)法完全達(dá)到要求，需要進(jìn)行專(zhuān)門(mén)的轉(zhuǎn)鹽或脫鹽。 

9. 多肽一般有哪幾種鹽的形式？通過(guò)什么方式轉(zhuǎn)鹽或脫鹽？
多數(shù)多肽都是在TFA體系下分離純化的，所以多肽以TFA鹽的形式最多，其次藥物肽一般有醋酸鹽及鹽酸鹽的形式，極少數(shù)藥物肽會(huì)有一些特殊的鹽形式。轉(zhuǎn)鹽方式多為離子交換法和HPLC法，而脫鹽可用透析袋和超濾膜。

10. TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)PH的作用？TFA的濃度越高基線漂移越厲害，那是不是說(shuō)TFA的濃度在緩沖液PH允許的情況下越低越好？
（1）TFA起到類(lèi)似離子對(duì)的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過(guò)高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長(zhǎng)時(shí)間使用可能影響柱子壽命。
（2）同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。
（3）走梯度時(shí)，因?yàn)樽叱苫�線漂移，但對(duì)制備的影響不大。