組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過乙酰膽堿酯酶反應系統(tǒng)中釋放出巰基膽堿，使用Ellman試劑后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物，出現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解樣品中酶活性的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體等）乙酰膽堿酯酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又稱為紅細胞膽堿酯酶（RBC cholinesterase），廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscular junction）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能突觸（cholinergic synapses）和紅細胞膜上高度表達，催化主要的神經(jīng)傳導介質乙酰膽堿的水解反應，產(chǎn)生乙酸和膽堿，終止突觸傳導。其功能在于調節(jié)乙酰膽堿作用。神經(jīng)毒氣，例如有機磷沙林（Sarin），抑制乙酰膽堿酯酶活性，導致神經(jīng)肌肉癱瘓，最終發(fā)生窒息（asphyxiation）。血清乙酰膽堿酯酶濃度顯著降低與有機磷殺蟲劑中毒有關，因此血液檢測是環(huán)境污染的重要指標。基于人工合成底物碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide）在乙酰膽堿酯酶的作用下，水解產(chǎn)生乙酸和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶反應系統(tǒng)為：

    Acetylcholinesterase 

acetylthiocholine iodide        →      acetate  +  thiocholine

DTNB  +  thiocholine  →   TNB +  choline-S-S-TNB

產(chǎn)品內容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  40毫升

反應液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）       4毫升

陰性液（Reagent F）     2毫升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/EM>）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作