蛋白-蛋白相互作用技術內(nèi)容

技術內(nèi)容

    蛋白質并非孤立存在的生物分子，而是具有特定三維空間結構并與其他蛋白質相互作用，共同執(zhí)行功能。因此，蛋白質的模塊及空間組織與其表達水平具有同樣的重要性。為了解析蛋白質組的組織結構單元而開發(fā)的基于質譜的蛋白質組學方法通常結合了質譜檢測與各種生化試驗。其中最經(jīng)典的技術為1999^[1]首次報導的親和純化－質譜技術（affinity purification – mass spectrametry，AP-MS）。既可進行大規(guī)模的protein interactome 構建^[2]，也能針對特定條件下特定蛋白質的互作進行差異分析、時間動態(tài)分析等^[3]。

圖１：AP-MS技術的兩種運用。

技術原理
    使用親和標簽 (AP-MS) 或特異性抗體 (CoIP-MS)，在native條件下純化與目標蛋白質相互作用的蛋白，進而使用質譜進行鑒定，通過test\control比對，過濾非特異結合蛋白，定性定量分析與特定蛋白質直接或間接作用的蛋白質。同時，結合 LFQ/TMT等定量技術，可以方便的研究特定蛋白互作關系隨時間的變化情況。

圖２：ＡＰ－ＭＳ技術實驗原理。

樣品要求

案例展示
    1、哈佛大學Steven P. Gygi教授實驗室運用高通量AP-MS技術，進行了２594組AP-MS實驗，鑒定了23744個相互作用，包括了7668個蛋白質，為研究蛋白尤其是功能未知蛋白提供了重要參考意義^[2] 。

圖３：高通量AP-MS技術．

2、為了更好的了解生物學過程的內(nèi)在動態(tài)變化情況，蘇黎世聯(lián)邦理工學院的Ruedi Aebersold教授實驗室運用AP-MS技術研究了14-3-3b scaffold protein 的蛋白互作組在IGF1刺激下，insulin-PI3K-AKT信號通路隨時間的動態(tài)變化過程^[3] 。

圖４：運用AP-MS研究14-3-3 scaffold protein 互作蛋白的時間動態(tài)關系，發(fā)現(xiàn)５種不同的cluster模式，對研究該信號通路的動態(tài)變化過程具有重大指導意義。

參考文獻
1. Rigaut, G.; Shevchenko, A.; Rutz, B.; Wilm, M.; Mann, M.; Seraphin, B., A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology 1999, 17 (10), 1030-2.
2. Huttlin, E. L.; Ting, L.; Bruckner, R. J.; Gebreab, F.; Gygi, M. P.; Szpyt, J.; Tam, S.; Zarraga, G.; Colby, G.; Baltier, K.; Dong, R.; Guarani, V.; Vaites, L. P.; Ordureau, A.; Rad, R.; Erickson, B. K.; Wuhr, M.; Chick, J.; Zhai, B.; Kolippakkam, D.; Mintseris, J.; Obar, R. A.; Harris, T.; Artavanis-Tsakonas, S.; Sowa, M. E.; De Camilli, P.; Paulo, J. A.; Harper, J. W.; Gygi, S. P., The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell 2015, 162 (2), 425-40.
3. Collins, B. C.; Gillet, L. C.; Rosenberger, G.; Rost, H. L.; Vichalkovski, A.; Gstaiger, M.; Aebersold, R., Quantifying protein interaction dynamics by SWATH mass spectrometry: application to the 14-3-3 system. Nat Meth 2013, 10 (12), 1246-1253.