液相色譜微型化：我們?yōu)槭裁催@樣做？

Evert-Jan Sneekes, Laurent Rieux 和Remco Swart

賽默飛世爾科技，荷蘭阿姆斯特丹

 

液相色譜 (LC) 微型化通常是為了提高靈敏度，這是蛋白質組學檢測低豐度肽和蛋白質的必然要求。微型化的其他優(yōu)點還包括提高與質譜連接的效率并降低溶劑的消耗。如今，微型化液相色譜更容易使用，它的儀器操作和連接方式均與常規(guī)液相色譜系統一樣。這為微型化液相色譜特別是毛細管和微流液相色譜應用于新的工作流程和應用領域提供了更多機會。

 

RSLCnano、納升液相色譜、毛細管液相色譜、微流液相色譜、質譜、nanoViper

 

微型化液相色譜技術的發(fā)展始于約三十年前，1987 年出現了首批商品化產品。隨著時間的推移，納升液相色譜成為生物分析研究不可或缺的工具，尤其是在要求最高級別靈敏度的蛋白質組學領域。然而，隨著納升液相色譜在蛋白質組學實驗室中的日常應用，人們有時會遺忘靈敏度提高的原理。了解這些原理及其實際影響有助于幫助人們看到微型化液相色譜將如何為蛋白質組學、生物分析等帶來益處。

 

為了解內徑較小的色譜柱會使靈敏度增加這一點，首先必須明確樣品濃度和樣品量之間的差異。這可以歸納如下：

• 液相色譜的樣品進樣是指一定體積的某濃度樣品的注入

- 這是一個固定量：例如 1 μL 1 pmol/μL = 1 pmol

• 進樣時，這個樣品固定量被液相色譜系統稀釋

- 這將得到一個新的濃度

• 在相同進樣量情況下，較小體積的液相色譜將產生較高濃度

- 與大內徑色譜柱相比，內徑較小的色譜柱靈敏度更高

 

 

圖1 顯示了在內徑分別為4.6 mm 和 75 μm 的色譜柱上注入相同進樣量（四條“肽”），顯然后者的濃度更高些。相對增加的靈敏度可以采用公式1 計算。

 

 

光學檢測器（如紫外檢測器）和電噴霧質譜儀屬于濃度敏感型儀器。它們的信號與從色譜柱洗脫峰中樣品的濃度成正比。

 

圖2 繪制了不同直徑的色譜柱較直徑為4.6 毫米的色譜柱的靈敏度相對增加（按公式1 計算）。從圖中可看出，內徑最�。�50 μm 和 75 μm）的色譜柱，其靈敏度在理論上可提高幾千倍。然而，插圖顯示色譜柱內徑從4.6 mm 變?yōu)? mm 時，靈敏度已能得到顯著提高（約20 倍）。在一些不要求絕對靈敏度，但微型化可以提供其它益處，例如與質譜輕松連接，減少溶劑用量（見計算示例）和廢液處置量并降低成本的情況下，這些色譜柱內徑范圍完全適合實際應用。

 

減少溶劑用量：

設想以如下參數在內徑為 4.6mm 的色譜柱上進行分析：

- 流速為1.0 mL / min

- 70％ 流動相A

- 2 公升溶劑瓶

所有流動相A 將在兩天內耗盡。

采用微流速液相色譜法以50 μL/min 的流速運行本應用，500 mL 的瓶子可維持一周。

 

 

圖2. 一系列內徑的色譜柱相較于內徑為4.6 mm 的色譜柱靈敏度的相對提高倍數

 

計算得出的靈敏度增量實際上是常規(guī)和微型化液相色譜應用之間的比例因子，而流速是最好的例子。通常情況下，常規(guī)液相色譜中的流速（內徑為4.6 mm）為1000-1200μL/min，納升級液相色譜（內徑為75μm）為0.250-0.300μL/min。4000 的比率反映內徑為4.6 mm 的色譜柱與納升級液相色譜柱之間的比例因子，并將導致兩個色譜柱的線性速度（大致）相同。

 

Thermo Scientific^TM Dionex^TM UltiMate^TM 3000 RSLCnano 系統（圖3）旨在為現代納升液相色譜提供所需的非常低的流速和非常高的壓力。UltiMate 3000 RSLCnano 系統在UHPLC 壓力條件下，提供的流速可低至20 nL/min*、高至50μL/min，使其成為可實現納升級、毛細管級和微流速液相色譜分析的完美儀器。1 模塊具有內置柱溫箱，可支持一系列應用，同時可最大限度地縮短各種元件之間的物理距離。這可使連接管盡可能地縮短。

 

連接管的另一個重要方面是管路內徑。納升級液相色譜 (20 μm) 的連接管內徑大約比常規(guī)管路內徑小10 倍。通常，毛細管級和微流速液相色譜分別采用內徑為50μm 和 75 μm 的連接管。

 

如果正確連接合適的管路，就會得到最好的結果。Thermo Scientific^TM Dionex^TM nanoViper^TM 接頭系統可提供廠制、手緊UHPLC 接頭，零死體積。nanoViper 接頭和連接管及色譜柱集于一體，無需工具即可組裝，且沒有引入死體積或連接時毛細管斷裂的風險。

* 要求時才會提供最低流速

 

 

圖3. UltiMate 3000 RSLCnano 系統、內視圖和nanoViper 接頭

 

 

微型化液相色譜通�？煞譃槿�類或三種流速范圍：納升級、毛細管級和微流速液相色譜。納升級液相色譜是指流速低于1000 nL/min的應用，毛細管級液相色譜包含低流速范圍 (1–10 μL/min) 的應用，而微流速液相色譜涵蓋流速超過10 μL/min 的應用。

 

以下是各流速范圍的典型應用示例。第一個也是最常見的示例，納升級液相色譜應用于蛋白質組學發(fā)現工作流程中。在這里，樣品量的限制是使用納升級液相色譜的主要原因。在第二個例子中，毛細管級液相色譜被應用于復雜基質中目標肽的定量分析。樣品可能較易得到，但通量也很關鍵，毛細管級液相色譜可做到二者兼顧。對于第三個示例，微流速液相色譜被用來提高單克隆抗體 (MAb) 消化物分析中的通量。在這里，樣品量不再是限制因素，但增加的靈敏度和系統耐用性很有價值。最后，給出一個非生物分析的例子。

 

在蛋白質組學研究中，研究人員面臨著雙重挑戰(zhàn)。待研究的蛋白質濃度低且樣品體積小，導致含量極低。此外，樣品非常復雜。這些因素促使開發(fā)出納升級液相色譜系統和具有非常高分離能力的色譜柱，確保特殊應用，如圖4 所示�？坪諣� (Köcher) 等人進行了類似的實驗，他們通過在 50 cm 的色譜柱上進行8 小時梯度洗脫，從而在胰蛋白酶消化的HeLa 細胞中平均鑒別出2516個蛋白質。²

 

圖4. 在75 μm（內徑）×50 cm 的納升級液相色譜柱上經10 小時梯度洗脫后高分辨率分離的大腸桿菌消化物

 

下一個例子是毛細管級液相色譜在目標定量工作流程中的應用。在本例中，選擇毛細管級液相色譜來增加通量、提高耐用性和易用性，同時保持很高的靈敏度。在內徑為300 μm 的色譜柱上分離出添加同位素標記肽的酵母消化物。樣品在30 分鐘內以流速4μL/min 被分離，并連接到采用標準HESI-II 接口的Thermo Scientific^TM TSQ Vantage^TM 三重四極桿質譜儀，在SRM 模式下進行檢測，檢測限達到10 amol（圖5）。更多詳情可參閱Thermo Scientific 的應用報告583。³

 

圖5. 按不同濃度向500 ng 酵母消化物基質中加入肽SAAGAFGPELSR 的提取色譜圖

 

以下微流速示例對生物制藥行業(yè)中高效率和高通量肽譜圖匹配應用特別適用。在這個特定例子中，首先以6 μL/min 流速通過30 分鐘梯度洗脫分離單克隆抗體消化物。在兩個連續(xù)步驟中，流速升高至15μL/min，同時梯度縮短。圖6 顯示了在不降低數據質量的情況下分析時間如何縮短到1/3。以類似的方式提高標準粒徑填料液相色譜柱上的流速，可能會使色譜系統與質譜儀的連接變得復雜，并需要每日更換兩次流動相。

 

圖6. 在300 μm（內徑）×15 cm 的 Thermo Scientific^TM Acclaim^TM PepMap^TM RSLC 分析柱上加速分析單克隆抗體Lys C 消化物

 

最后，Xiang He 等人展示了微流速液相色譜在法醫(yī)毒理學等領域取得的可喜成果。4 建立了簡便、高靈敏的方法，可量化分析生物樣品中的大麻素，滿足法醫(yī)毒理學的需要。這種方法在設計和循環(huán)時間上與典型的標準粒徑填料應用類似，但靈敏度更高，可以分析進一步稀釋的樣品。法醫(yī)毒理學者可將這種多用途的工作流程應用于其他常見的非法/ 濫用藥物定量分析。試劑的消耗量也會顯著降低90％以上，并降低質譜儀的維護頻率。

 

液相色譜儀的微型化通常僅被認為與蛋白質組學研究所要求的可提供更高靈敏度的納升級液相色譜相關。但是，毛細管級和微流速液相色譜已大幅度提高了靈敏度。此外，在整個流速范圍內（從納升級到傳統規(guī)格），可以保證UHPLC 的能力，大大簡化了分析的規(guī)模，而且不會影響到性能。

 

雖然蛋白質組學仍是納升級液相色譜應用的主要焦點，但在生物制藥和法醫(yī)/ 毒理學應用方面亦有很多潛力。如前所述，用戶使用微型化液相色譜不但能提高靈敏度，而且更輕松地與質譜連接，同時還大幅降低了樣品和溶劑的消耗量。這不但補償了延長的操作時間，還降低了操作成本。切換到毛細管級液相色譜或微流速液相色譜意味著靈敏度和耐用性、通量和易用性之間達到完美平衡。

 

所以重新回到標題中的問題：“液相色譜儀的微型化; 為什么我們這樣做呢？”，因為有很多裨益！

 

1. Rieux, L.; Sneekes, E-J.; Swart, R. Nano LC: Principles, Evolution, and State-of-the-Art of the Technique. LCGC NA2011, 29 (10), 926–934, [Online] http://www.chromatographyonline. com/lcgc/ Column%3A+Innovations+in+HPLC/Nano-LC-Principles-Evolution-and-State-of-the- Art

/ArticleStandard/Article/detail/745381 (accessed August 7,2013).

2. Köcher, T.; Swart, R.; Mechtler, K. Anal. Chem. 2011, 83, 2699–2704.

3. Kiyonami, R.; Swart, R; Zabrouskov, V.; Huhmer, A. Increased Robustness and Throughput for Targeted Protein Quantification Using Capillary Flow and a Conventional ESI Probe, Thermo Scientific Application Note 583, [Online] http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/techres ource

resourceId=102334&storeId=11152&from=search# (accessed August 7, 2013).

4. He, X.; Kozak, M.; Nimkar, S. Anal. Chem. 2012, 84 (18), 7643–7647.