創(chuàng)新數據非依賴性采集用于復雜基質目標蛋白質的定量分析

張偉¹ Reiko Kiyonami² 江崢^*1 陳偉¹

¹(賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海201206) ²(ThermoFisher Scientific, San Jose, CA, USA)

 

摘要 數據非依賴性采集(DIA)是隨著定量蛋白質組學而建立的質譜掃描技術。DIA 能夠獲得掃描范圍內所有母離子及二級子離子信息,不會造成低豐度離子信息的丟失,同時突破了高分辨質譜二級定量的通量限制。本研究基于靜電場軌道阱Q-qIT-OT 三合一質譜,發(fā)展了經典DIA 方法以及WiSIM-DIA 和Full MS-DIA兩種全新DIA 方法,并對Hela 細胞全蛋白中添加的10 條低濃度肽段進行定量分析,考察方法的線性、重現(xiàn)性和靈敏度。結果表明,3 種方法的定量限均低至amol (14 ~435 amol),并展示出良好的線性和定性確證可靠性。其中,WiSIM-DIA 基于超高分辨一級監(jiān)測定量,與經典DIA 優(yōu)勢互補;Full MS-DIA 的選擇窗口僅3 amu,能夠直接進行搜庫鑒定,實現(xiàn)了數據依賴性采集(DDA)和DIA 的統(tǒng)一,擺脫了DIA 依賴于DDA 建立譜圖庫的局限性。

 

關鍵詞 靜電場軌道阱; 數據非依賴性采集; 蛋白質組學; 絕對定量

 

數據依賴性采集(Data dependent acquisition, DDA)是串聯(lián)質譜非目標化合物分析的主要手段。蛋白質組學的經典策略-鳥槍法(Shotgun)即基于DDA 發(fā)展而來,利用一級全掃描檢測肽段母離子,然后按信號強度排列,將前若干位的母離子依次選擇、碎裂,并掃描二級碎片離子。同時,動態(tài)排除、價態(tài)排除、中性丟失/ 診斷離子觸發(fā)等技術,使DDA 盡可能多地采集有效肽段譜圖,實現(xiàn)鑒定結果最大化[1] �；�于鳥槍法,蛋白質組學已經實現(xiàn)酵母蛋白質組接近完全覆蓋,人類蛋白質組也已達到50% 以上的基因組覆蓋和7 個數量級的動態(tài)范圍[2,3] 。然而,DDA 的局限性也逐漸顯現(xiàn):(1) 先強后弱的采集方式易造成低豐度肽段信息丟失;(2) 母離子選擇有一定的隨機性,造成重現(xiàn)性不佳;(3) 每個循環(huán)獲得的譜圖數量不一,造成掃描點數不均勻,影響定量分析準確性。

 

目標蛋白質組學針對目標蛋白/ 肽段離子實時監(jiān)測和采集,避免了DDA 的信息丟失和重現(xiàn)性問題。主要采集方法包括選擇離子監(jiān)測(Selected ion monitoring, SIM)、基于三重四極桿的選擇反應監(jiān)測(Selected reaction monitoring, SRM)和基于高分辨質譜的平行反應監(jiān)測(Parallel reaction monitoring, PRM),是目標蛋白驗證和絕對定量的有效手段[4,5] 。但是目標性的采集方法需要指定目標肽段,對于未知肽段無法采集;通量限制也使得一次實驗只能監(jiān)測數量有限肽段或離子對,難以滿足大規(guī)模蛋白分析的需要。

 

數據非依賴性采集(Data independent acquisition, DIA)使用25 amu 或更大間隔將整個質量范圍等分為若干窗口,每個窗口依次選擇、碎裂、掃描。DIA 能夠獲得質量范圍內所有母離子的全部碎片離子信息,通量無上限,循環(huán)時間固定,同時數據可以回溯,有效解決了DDA 和目標采集方法存在的問題[6] 。目前,已發(fā)展了多種基于飛行時間(Q-TOF)、靜電場軌道阱(Orbitrap)和離子阱的DIA 方法[7] 。Gillet 等使用32 個連續(xù)的25 amu 窗口,基于Q-TOF (TripleTOF 5600)發(fā)展了SWATH 技術,并證明該技術的定量能力與SRM 相當[8] 。Egertson 等利用Q-Orbitrap (Q Exactive)獨有的多重掃描功能(Multiplexing,MSX)發(fā)展了MSX-DIA 技術,將選擇窗口縮小到4 amu,最大程度減少了共流出肽段和雜質的干擾[9] 。

 

然而,傳統(tǒng)數據非依賴性采集仍存在諸多局限:(1) 由于掃描速度的限制,DIA 難以使用超高分辨率掃描;(2) DIA 的大窗口選擇引入較大干擾,雖然MSX-DIA 縮小了選擇窗口,但需要特定的算法解析數據,增加了工作量;(3) DIA 依賴于DDA 建立的譜圖庫進行匹配,實現(xiàn)定性確證和定量離子選擇,因此DDA 鑒定不到的蛋白,DIA 也無法分析。

 

本研究基于四極桿-靜電場軌道阱-線性離子阱(Q-OT-qIT)三合一質譜,利用添加10 條低濃度肽段的Hela 樣本,發(fā)展并考察了3 種數據非依賴性采集方法,包括經典的DIA、全新的寬窗口SIM 掃描DIA(WiSIM-DIA)和全掃描DIA (Full MS-DIA),定量限均達到amol 水平,線性、重現(xiàn)性良好。其中,WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 基于24 萬超高分辨率,利用一級精確質量數定量、二級離子阱定性確證,進一步縮小了選擇窗口,提高了檢測特異性。此外,Full-MS DIA 可以直接搜庫,實現(xiàn)了DDA 與DIA 的統(tǒng)一,蛋白鑒定數量與DDA 相當,擺脫了譜圖庫的限制�；�于Q-OT-qIT 的數據非依賴性采集方法靈活多樣、流程簡單有效,在目標蛋白質組學領域具有廣闊的應用前景。

 

Orbitrap Fusion 三合一質譜儀、EASY-nLC 1000 納流超高效液相色譜(Thermo Fisher Scientific)。標準肽段由生工生物(上海)股份有限公司合成;乙腈、甲酸(Thermo Fisher Scientific);其它試劑均購自Sigma-Aldrich 公司。

 

取適量Hela 細胞沉淀,加入含7 mol/ L 尿素、2 mol/ L 硫脲、1 mmol/ L 苯甲基磺酰氟(PMSF) 和50 mmol/ L 二硫蘇糖醇(DTT)的蛋白提取液,在超聲細胞破碎儀中超聲3 次各5 s。冰上放置20 min后,4 益離心(15000 g) 30 min, 取上清液,Bradford 法確定總蛋白濃度。向蛋白提取液中加入DTT(終濃度10 mmol/ L),于56 益振蕩30 min。加入碘乙酰胺(終濃度50 mmol/ L),室溫避光振蕩40 min。反應后加入6 倍體積的預冷丙酮,-20 益放置3 h,4 益離心(15000 g)30 min, 棄上清液。將蛋白沉淀溶于50 mmol/ L NH4HCO3 溶液,加入胰蛋白酶Trypsin(酶頤蛋白為1頤40, w / w),37 益酶解過夜。將全蛋白酶解液稀釋至終濃度為100 mg/ L。

 

等重稱取10 條標準肽段粉末,混合后使用0. 1%甲酸溶液充分溶解為1 g/ L 肽段混合溶液(總濃度10 g/ L)。肽段混合溶液進一步使用100 mg/ L Hela 酶解液逐級稀釋為7 種濃度梯度(200, 50, 10, 2, 0.5,0.1 和0.02 mg/ L)溶液。另取少量標準肽段溶液用水稀釋至500 mg/ L, 用作PRM 掃描,構建譜圖庫。

 

色譜柱:自制納流C18 色譜柱(3 滋m, 100 魡, 75 滋m 伊15 cm);上樣量: 1 滋L;流速:300 nL/ min;A 相: 0. 1%甲酸溶液;B 相: 0. 1% 甲酸-乙腈溶液;分析梯度:0 ~4 min,3% ~10% B;4 ~74 min,10%~35% B;74 ~78 min,35% ~90% B;78 ~90 min,90% B。

 

離子源:nano-Flex 納噴霧離子源;掃描模式:正離子;噴霧電壓:2. 2 kV;離子傳輸管溫度:275 益;RF-lens:60%。

 

DDA 掃描:一級掃描模式:全掃描;一級掃描范圍:m / z 300 ~ 1800;一級檢測:Orbitrap(分辨率240 K);選擇模式:四極桿;選擇窗口:2 amu;碎裂模式:CID;碎裂能量:30%;二級檢測:離子阱;動態(tài)排除:60 s;循環(huán)時間:3 s。

 

PRM 掃描:母離子列表:10 條標準肽段的精確質量數;選擇模式:四極桿;選擇窗口:2 amu;碎裂模式:HCD;碎裂能量:30%;二級檢測:Orbitrap(分辨率30 K);循環(huán)模式:按母離子列表依次掃描。

 

DIA 方法:母離子列表:m / z 510 ~890, 間隔20 amu;選擇模式:四極桿;選擇窗口:20 amu;碎裂模式:HCD;碎裂能量:30%;二級檢測:Orbitrap(分辨率30 K);二級掃描范圍:m / z 150 ~2000;循環(huán)模式:按母離子列表依次掃描。

 

WiSIM-DIA 方法:一級掃描模式:SIM;一級選擇模式:離子阱;一級掃描范圍:m / z 400 ~ 600, m / z600 ~800, m / z 800 ~1000;一級檢測:Orbitrap(分辨率240 K);母離子列表:m / z 406 ~598, m / z 606 ~798, m / z 806 ~998 間隔12 amu;二級選擇模式:四極桿;選擇窗口:12 amu;碎裂模式:CID;碎裂能量: 30%;二級檢測:離子阱;二級掃描范圍:m / z 150 ~2000;循環(huán)模式:3 個SIM+3 個母離子列表依次掃描。Full MS-DIA 方法:一級掃描模式:全掃描;一級掃描范圍: m / z 400 ~1000;一級檢測:Orbitrap(分辨率240 K);母離子列表:m / z 401. 5 ~518. 5, m / z 521. 5 ~638.5, m / z 641. 5 ~758. 5, m / z 761. 5 ~878. 5,m / z 881.5 ~998.5, 間隔3 amu;選擇模式:四極桿;選擇窗口:3 amu;碎裂模式:CID;碎裂能量:30%;二級檢測:離子阱;二級掃描范圍:m / z 150 ~2000;循環(huán)模式:5 個一級全掃描+5 個母離子列表依次掃描。

 

標準肽段PRM 數據使用Proteome Discoverer 1. 4 軟件進行搜庫鑒定,母離子質量精度:10 ppm,子離子質量精度:0. 02 Da。鑒定結果作為譜圖庫進行DIA 的定性確證和定量離子挑選。DIA 數據使用Pinpoint 1. 4 軟件進行譜圖庫離子篩選、定性確證、定量分析和標準曲線繪制。質量精度設置同上,母離子定量選擇單同位素峰和第一個同位素峰,子離子定量選擇強度最高的2 個y 離子,定性確證選擇強度最高的8 個子離子。100 ng Hela 細胞全蛋白DDA 和Full MS-DIA 數據使用Proteome Discoverer 1. 4 軟件進行Uniprot 人類蛋白數據庫搜庫鑒定與比較,質量精度設置同上(Full MS-DIA 母離子質量精度設置為1. 5 Da),可變修飾:甲硫氨酸氧化(M+15. 995 Da),固定修飾:半胱氨酸脲甲基化(C+57. 021 Da)。鑒定結果使用Percolator 進行嚴格卡值(q<0. 01)。

 

數據非依賴性采集依次掃描整個質量范圍的所有母離子及二級子離子,循環(huán)時間長,因此對質譜掃描速度要求高。目前,主要的DIA 方法的質譜掃描速度均在10 Hz 左右,例如SWATH 等,因此采用較大選擇窗口(25 ~50 amu),以縮短循環(huán)時間(約2. 5 ~3. 2 s)。Q-qIT-OT 三合一質譜集四極桿、線性離子阱和Orbitrap 3 種質量分析器為一體,Orbitrap 掃描速度達到15 Hz,線性離子阱達到20 Hz,為縮短傳統(tǒng)DIA 的選擇窗口、降低干擾、提高靈敏度提供了可能[10] 。

 

本研究首先基于四極桿和Orbitrap,建立了經典DIA 方法(圖1A):使用20 amu 選擇窗口,利用Orbitrap 30K 高分辨率和HCD 高能碎裂,依次選擇、碎裂、掃描整個質量范圍(m / z 500-900),循環(huán)時間僅為1. 9 s,數據處理時挑選強度最高的子離子組成母子離子對進行色譜峰提取和定量。此外,利用線性離子阱的高靈敏度和高掃描速度,建立了兩種基于一級定量的新方法:寬窗口SIM 掃描DIA (WiSIM-DIA)和全掃描DIA (Full MS-DIA)。

 

WiSIM-DIA(圖1B)利用200 amu 寬窗口篩選母離子,在m / z 400 ~1000 范圍依次使用Orbitrap 進行240 K 超高分辨離子監(jiān)測掃描,最大程度排除基質干擾,基于一級精確質量數進行定量。在每個SIM掃描之后,利用12 amu 窄窗口選擇母離子,在質量范圍內依次進行線性離子阱二級碎片離子掃描,基于二級譜圖實現(xiàn)定性確證。

 

Full MS-DIA(圖1C)在WiSIM-DIA 基礎上將12 amu 選擇窗口縮短到3 amu,達到與DDA 相當的選擇窗口,但掃描窗口數量增加了4 倍。為了避免循環(huán)時間過長對定量造成的影響,在m / z 400 ~1000 的質量范圍內插入5 個Orbitrap 240 K 超高分辨一級全掃描以保證掃描點數。Full MS-DIA 一級掃描間隔僅2. 6 s,保證了定量結果的可靠性。

 

肽段納流液相分離的出峰時間一般在30 s 以上,因此在合適的循環(huán)時間內,3 種DIA 方法可以根據樣本復雜程度靈活調節(jié)質量范圍、分辨率、選擇窗口等參數,達到最佳分析效果。例如,分析分子量較大的肽段時,質量范圍可以調整為m / z 400 ~1200 或更寬。

 

 

圖1 基于Q-qIT-OT 的3 種數據非依賴性采集原理。(A)經典數據非依賴性采集DIA;(B)寬窗口SIM 掃描

DIA (WiSIM-DIA);(C)全掃描DIA (Full MS-DIA)

 

Fig. 1 Schematic illustrating quadrupole-ion-orbitrap (Q-qIT-OT) based three data-independent acquisition (DIA) methods. (A) Classic DIA, (B) Wide isolation window SIM scan DIA (WiSIM-DIA), (C) Full scan DIA (Full MS-DIA)

 

為了考察與比較3 種DIA 方法的分析效果,實驗對Hela 細胞全蛋白酶解液中添加的10 條低濃度肽段進行了數據采集。10 條合成的標準肽段均來自于非人源的植物蛋白,分子量在1100 ~1700 Da 之間,具有高度特異性。標準肽段溶液使用100 mg/ L Hela 細胞酶解液逐級稀釋為7 種濃度梯度,并逐一使用3 種DIA 方法采集(上樣量1 滋L),考察方法的選擇性、線性、重現(xiàn)性和靈敏度。圖2 展示了50 mg/ L 濃度肽段樣本的總離子流圖(TIC)、目標肽段YLGYLEQLLR (m / z 634. 356, 2+)的提取離子流圖(XIC)和子離子譜圖(MS/ MS)。由于Hela 細胞樣本高度復雜,標準肽段的色譜峰在TIC 中被完全掩蓋。另外,相比WiSIM-DIA 和Full MS-DIA,DIA 只有二級掃描沒有一級掃描,因此TIC 均由二級譜圖構成,信噪比相對較低。進一步提取該肽段的XIC 圖,其中DIA 基于子離子定量,選擇最強子離子m / z 991. 557 形成634. 356 ~991. 557 母子離子對提取色譜峰;WiSIM-DIA 和Full MS-DIA基于母離子定量,利用母離子精確質量數m / z 634. 356 提取色譜峰。通過比較XIC 可以看出,在復雜Hela 細胞基質中,3 種方法均能有效排除干擾。

 

 

圖2  3種數據非依賴性采集分析Hela 細胞樣本中的標準肽段。(A) DIA、(B) WiSIM-DIA 和(C) Full MS-DIA 的TIC 圖、肽段YLGYLEQLLR 離子對XIC 圖和MS/ MS 圖

 

Fig. 2Analysis of standard peptides spiked in Hela cell digest by the three DIA methods. TICs, peptide YLGYLEQLLR XICs and MS/ MS spectra of (A) classic DIA, (B) WiSIM-DIA and (C) Full MS-DIA data

 

肽段YLGYLEQLLR 的出峰時間約為35 s,3 種DIA 在出峰時間內掃描點數均達到10 以上,分別為22, 14, 14,具有良好的色譜峰型和可靠的定量峰面積。

 

MS/ MS 譜圖顯示了3 種選擇窗口下二級碎片離子的掃描結果。DIA 的選擇窗口最大(20 amu),質譜峰最多,但Orbitrap 高分辨掃描能夠有效區(qū)分碎片離子,因此譜圖具有良好的信噪比,可以有效用于定性與定量分析。WiSIM-DIA 窗口縮短為12 amu,但屬于線性離子阱低分辨掃描,因此質譜峰的區(qū)分能力相對較弱,造成一定干擾。Full MS-DIA 窗口僅3 amu,與DDA 相當,把基質干擾降到了最低,提供了良好的定性確證信息。

 

 

數據進一步使用Pinpoint 1. 4 軟件處理,考察方法在100 ng 復雜Hela 細胞基質下,20 ~200 pg 低濃度肽段范圍內的線性、重現(xiàn)性和靈敏度。并以10 條標準肽段的PRM 數據鑒定結果作為譜圖庫,進行譜圖匹配和定性確證。DIA 選取標準譜圖中強度最高的8 個子離子作為定性確證依據,并提取其中最好的2 個y 離子進行定量分析。WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 同樣選取最強的8 個子離子進行定性確證,定量分析則使用一級母離子的單同位素峰和相鄰的第一個同位素峰。

 

以肽段YLGYLEQLLR ( m / z 634. 356, 2+) 為例, DIA 數據選取最強的y8 ( m / z 991. 557) 和y6 (m / z 771. 472)作為定量離子對,繪制標準曲線(圖3A)。曲線在100 fg ~ 50 pg 范圍內顯示出良好的線性,同時, 8 個定性確證離子與譜圖庫中的標準譜圖高度匹配,強度比例一致。WiSIM-DIA 選取單同位素峰M (m / z 634. 356)和相鄰同位素峰M+1 (m / z 634. 857)進行定量分析,在100 fg ~200 pg 范圍內具有良好的線性關系(圖3B)。WiSIM-DIA 二級為低分辨掃描,易受基質和共流出肽段碎片的干擾,但由于選擇窗口較小,因此也顯示出良好的子離子譜圖匹配結果。Full MS-DIA 定量流程與WiSIM-DIA完全一致,方法在500 fg ~200 pg 范圍內顯示出良好的線性關系,同時定性確證結果良好(圖3C)。

 

 

圖3 肽段YLGYLEQLLR 使用3 種數據非依賴性采集的定性定量結果。(A) DIA、(B) WiSIM-DIA 和(C) Full MS-DIA 的定量離子對XIC 圖、標準曲線和譜圖匹配確證圖。匹配確證柱狀圖從左到右依次為0. 5, 2, 10, 50 和200 mg/ L 和標準譜圖

 

Fig. 3 Confirmation and quantification of peptide YLGYLEQLLR using the three DIA methods. Quantification ion XICs, standard curves and spectra library matching charts of (A) classic DIA, (B) WiSIM-DIA and (C) Full MS-DIA data. The columns of spectra library matching charts represent 0. 5, 2, 10, 50 and 200 mg/ L and library spectrum from left to right, respectively

 

對10 條肽段的分析結果匯總(表1),結果表明,3 種DIA 方法在fg ~ pg 數量級肽段范圍內均顯示出良好的線性、重現(xiàn)性和靈敏度。3 種方法的最低定量限均達到amol 級,其中肽段GEEMEEMVQSAR在DIA 中最低定量限達14 amol,超越了常規(guī)SRM 和PRM 的定量水平。比較3 種方法可以看出,DIA與WiSIM-DIA 結果差異不大,證明了基于高分辨的二級定量和基于超高分辨的一級定量選擇性相當,均能有效排除基質和共流出肽段的干擾,定量能力出色。兩種方法又各有特點,形成優(yōu)勢互補:DIA 通過四極桿和Orbitrap 兩級篩選,能有效分析極復雜的樣品;WiSIM-DIA 使用母離子定量,避免了碎裂過程中的損失,在相對簡單的基質中靈敏度更高。

 

表1  3種數據非依賴性采集的線性范圍、重現(xiàn)性、靈敏度

Table 1 Linearity, reproducibility and sensitivity of the three DIA methods

 

 

由于選擇窗口過大,同時二級譜圖無法與一級母離子相關聯(lián),傳統(tǒng)數據非依賴性采集無法直接搜庫,需要譜圖庫匹配才能進行定性確證,使DIA 的應用受制于DDA。

 

Full MS-DIA 基于一級全掃描定量,母離子未經過前級質量分析器選擇,因此相比DIA 和WiSIM-DIA 受到的干擾更大,靈敏度略低。但是,Full MS-DIA 將二級選擇窗口縮短到3 amu,與傳統(tǒng)DDA 的選擇窗口相當,能夠作為低分辨數據,直接用于數據庫檢索(相當于母離子質量精度為依1. 5 amu),擺脫了譜圖庫的限制,實現(xiàn)了DDA 與DIA 的統(tǒng)一。

 

圖4 展示了肽段YLGYLEQLLR 譜圖的直接搜庫結果。DDA 通常以2 amu 為選擇窗口,與Full MS-DIA 3 amu 選擇窗口相差不大。搜庫時,Full MS-DIA 一級質量精度以窗口寬度為限,即依1. 5 amu,類似于低分辨質譜DDA 數據的搜庫鑒定。結果顯示,Full MS-DIA 與DDA 的二級譜圖高度相似,雖然Full MS-DIA 譜圖等同于低分辨數據,但鑒定結果沒有明顯差異,序列匹配完全一致。

 

 

圖4肽段YLGYLEQLLR 譜圖與搜庫鑒定結果。(A) DDA 和(B) Full MS-DIA 的一級選擇窗口和二級鑒

定圖

 

Fig. 4Spectra and database search results of peptide YLGYLEQLLR. MS isolation window and MS/ MS identifica-tion of (A) data dependent acquisition (DDA) and (B) Full MS-DIA data

 

為了考察Full MS-DIA 用于搜庫鑒定的可行性,實驗進一步對100 ng Hela 細胞全蛋白進行DDA 和Full MS-DIA 采集,數據使用Uniprot 人類蛋白數據庫搜庫鑒定(表2)。其中,DDA、Full MS-DIA 一級質量精度分別為10 ppm、1. 5 Da,二級質量精度均為0. 6 Da,卡值標準為q<0. 01 (Percolator)。結果顯示,DDA 共鑒定15575 條肽段,對應3228 個非冗余蛋白;Full MS-DIA 共鑒定10515 條肽段,對應2835 個非冗余蛋白。后者鑒定結果少于前者,主要是兩者掃描范圍不同造成的,Full MS-DIA 需考慮掃描點數,因此掃描范圍較窄;此外,兩者蛋白數的差異明顯小于肽段數,這是由于非冗余肽段主要集中在m / z 400 ~1000 范圍,掃描范圍較窄對蛋白鑒定影響較小。

 

表2 100 ng Hela 細胞全蛋白樣本DDA 與Full MS-DIA 掃描參數、搜庫參數和鑒定結果(n =3)

Table 2  MS scan parameters, database search parameters and identification results of DDA and full MS-DIA analysis of 100 ng Hela cell tryptic digest (n =3)

 

 

DDA 與Full MS-DIA 的蛋白鑒定結果重合度高,表明質量精度對鑒定結果影響不大(圖5A)。通過比較肽段VVIGMDVAASEFFR 的二級譜圖匹配可以看出,兩種方法采集的二級譜圖非常相似,碎片匹配也幾乎一致(圖5B)。以上數據證明,Full MS-DIA 可以直接用于數據庫檢索鑒定蛋白,并獲得可靠的鑒定結果,實現(xiàn)了DDA 與DIA 的統(tǒng)一。

 

圖5 100 ng Hela 細胞全蛋白樣本DDA 與Full MS-DIA 鑒定結果比較。(A) 兩種方法蛋白鑒定結果比較;(B) 兩種方法二級譜圖匹配比較(肽段VVIGMDVAASEFFR)

 

Fig. 5 Comparison of identification results of 100 ng Hela cell digest by DDA and Full MS-DIA methods. (A) Comparison of identified number of proteins, (B) Comparison of identified MS/ MS spectra (peptide VVIGMD-VAASEFFR)

 

 

基于靜電場軌道阱Q-qIT-OT 質譜建立DIA、WiSIM-DIA、Full MS-DIA 3 種數據非依賴性采集方法, 并使用添加10 條低濃度肽段的Hela 細胞全蛋白樣本對方法進行考察。結果表明,3 種方法的定量限均在14 ~435 amol 范圍內,線性關系與重現(xiàn)性良好,定性確證可靠性高。其中,WiSIM-DIA 基于超高分辨SIM 定量,與經典DIA 二級定量具有一定的互補性;而Full MS-DIA 將二級選擇窗口縮短到3 amu,實現(xiàn)了DIA 數據直接搜庫鑒定,共從100 ng Hela 細胞全蛋白樣本鑒定到2835 個非冗余蛋白,與DDA 鑒定結果重合度高�；�于Q-qIT-OT 的創(chuàng)新數據非依賴性采集方法為定量蛋白質組學提供了全新視角與策略。

 

1 Kalli A, Smith G T, Sweredoski M J, Hess S. J. Proteome Res. , 2013, 12(7): 3071-3086

2 Nagaraj N, Kulak N A, Cox J, Neuhauser N, Mayr K, Hoerning O, Vorm O, Mann M. Mol. Cell. Proteomics, 2012,11(3): M111. 013722

3 Geiger T, Wehner A, Schaab C, Cox J, Mann M. Mol. Cell. Proteomics, 2012, 11(3): M111. 014050

4 Gallien S, Duriez E, Crone C, Kellmann M, Moehring T, Domon B. Mol. Cell. Proteomics, 2012, 11(12): 1709-1723

5 Gallien S, Duriez E, Demeure K, Domon B. J. Proteomics, 2013, 81: 148-158

6 Chapman J D, Goodlett D R, Masselon C D. Mass Spectrom. Rev. , 2013: 10. 1002/ mas. 21400

7 Law K P, Lim Y P. Expert Rev. Proteomics, 2013, 10(6): 551-566

8 Gillet L C, Navarro P, Tate S, Rost H, Selevsek N, Reiter L, Bonner R, Aebersold R. Mol. Cell. Proteomics, 2012,11(6): O111. 016717

9 Egertson J D, Kuehn A, Merrihew G E, Bateman N W, MacLean B X, Ting Y S, Canterbury J D, Marsh D M, Kellmann M, Zabrouskov V, Wu C C, MacCoss M J. Nat. Methods, 2013, 10(8): 744-746

10 Senko M W, Remes P M, Canterbury J D, Mathur R, Song Q, Eliuk S M, Mullen C, Earley L, Hardman M, Blethrow J D, Bui H, Specht A, Lange O, Denisov E, Makarov A, Horning S, Zabrouskov V. Anal. Chem. , 2013, 85(24):11710-11714

 

 

ZHANG Wei1 , Reiko Kiyonami2 , JIANG Zheng*1 , CHEN Wei1

 

1(Thermo Fisher Scientific, Shanghai 201206, China)

2(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)

 

AbstractData independent acquisition ( DIA) is a novel MS scan mode for quantitative proteomics,acquiring all precursors as well as fragments without any loss of low abundant ions, and breaks the throughput limitation of product ion quantification by high-resolution MS. Here we developed three DIA methods on quadrupole-linear ion trap-Orbitrap (Q-qIT-OT) Tribrid MS, classic DIA, as well as novel wide isolation window SIM scan (WiSIM)-DIA and full scan-DIA (Full MS-DIA). Quantitative analysis of 10 low abundant peptides spiked in Hela cell digest was performed by the three methods for linearity, reproducibility and sensitivity evaluation. The results showed that the LOQs reached amol level (14 -435 amol) with good linearity and effective MS/ MS confirmation. WiSIM-DIA utilizes ultra-high resolution SIM scan for quantification complementary with classic DIA. The isolation window of Full MS-DIA was down to 3 amu, and the data could be directly used for database searching, thus realizing the integration of data dependent acquisition (DDA) and DIA, and avoiding the limitation of using spectra library.

 

Keywords Orbitrap; Data independent acquisition; Proteomics; Absolute quantification

 

(Received 24 April 2014; accepted 4 July 2014）