Annexin V凋亡檢測常見問題分析
常見問題分析：
實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低。
• 確定實驗中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡。可通過設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)效果的陽性藥物對照來排除這一情況。
• 貼壁細胞消化不當。Annexin V 跟PS 的結(jié)合需要Ca2+離子，結(jié)合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會影響染色，建議使用無EDTA 的胰酶，或者消化后用PBS洗滌干凈。
• 細胞離心用冷PBS 洗滌后，應(yīng)盡量吸干殘余液體，殘余過多的PBS 中含有磷酸根，會形成磷酸鈣沉淀，影響Annexin V的染色。
• Annexin V結(jié)合液瓶蓋要蓋緊密封，長時間暴露于空氣后，空氣中的CO2 進入后形成CaCO3 會產(chǎn)生沉淀，從而減少游離的Ca2+，導(dǎo)致實驗的結(jié)果不佳。
• 污染其他的緩沖液。如吸取PBS后不更換Tip 頭會導(dǎo)致游離的Ca2+的減少，從而導(dǎo)致實驗的結(jié)果不佳。
• 陽性細胞的丟失。如果是貼壁細胞，藥物誘導(dǎo)后漂浮的細胞要收集起來合并檢測，這部分細胞往往是凋亡陽性的細胞，丟棄會造成陽性結(jié)果偏低。
實驗過程中陽性率偏高。
• 細胞本身活力太差。實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對照細胞經(jīng)染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細胞比例過高，造成這種結(jié)果的原因可能是細胞本身活力太差。建議用臺盼藍染色計算細胞的活力，臺盼藍拒染的細胞應(yīng)大于95%。若活力偏低低，建議重新復(fù)蘇細胞，通常剛復(fù)蘇的細胞至少要傳代3 次以后才能進行實驗。
• 細胞操作不當。貼壁細胞消化過程中反復(fù)劇烈吹打?qū)е录毎て茐�，使得假陽性偏高�?BR> • 凋亡誘導(dǎo)時間過長。一般情況下誘導(dǎo)幾個小時就可以出現(xiàn)早期凋亡，因此通常不需要處理大于48 小時以上，誘導(dǎo)時間過長會使營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細胞狀態(tài)差，假陽性結(jié)果偏高。
