Caspase活化、核染色質(zhì)固縮及DNA片段化

瀏覽次數(shù)：8417　發(fā)布日期：2014-4-4　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

Life Technologies提供了用于細胞功能和健康檢測的各種試劑。其中許多分析以熒光或比色法為基礎(chǔ)，具有靈敏性、便利性和安全性。這些產(chǎn)品已經(jīng)過多種儀器平臺驗證，包括顯微鏡、流式細胞儀、酶標儀和高內(nèi)涵篩選，能夠?qū)崿F(xiàn)各種細胞功能的分析：

細胞活性和細胞毒性
細胞增殖和細胞周期
細胞凋亡
自噬
氧化應激
內(nèi)吞作用和吞噬作用
細胞內(nèi)離子

細胞凋亡(細胞程序性死亡)是細胞正常發(fā)育過程中，由遺傳控制的細胞消亡現(xiàn)象。凋亡調(diào)控異常與許多疾病狀態(tài)有關(guān)，例如阿爾茨海默病、中風以及癌癥。區(qū)別于壞死細胞的是，凋亡細胞的形態(tài)學特征為核染色質(zhì)固縮、細胞皺縮以及產(chǎn)生膜包裹凋亡小體。細胞凋亡的生物化學特征在于基因組的片段化及幾種細胞蛋白的解離或降解。
與細胞活性一樣，無法通過任何單一參數(shù)來準確界定細胞徹底死亡；因而采用幾種不同的方法研究細胞凋亡通常十分有利。候選抗腫瘤藥物若無法誘導細胞凋亡，其臨床功效通常較差，因此凋亡分析成為重要的高通量藥物篩選工具。

3.1 活細胞caspase檢測

Vybrant® FAM Caspase Assay Kit和Image-iT® LIVE Caspase Detection Kit以新穎技術(shù)檢測活細胞中活化的caspase，利用的是caspase的熒光抑制劑(FLICA™)。此試劑中的FMK可通過caspase特異性氨基酸序列與cysteine進行共價反應，并接上carboxyfluorescein基團(FAM)作為信號報告分子。FLICA™可通過識別序列與活化的caspase的酶反應中心相互作用，接著通過FMK共價結(jié)合。FLICA™抑制劑可穿透細胞，且不具細胞毒性。未結(jié)合的FLICA™分子會擴散至細胞外，經(jīng)沖洗即可去除；剩余的綠色熒光信號則可直接反映出加入抑制劑時處于活化狀態(tài)的capase量。Vybrant® FAM Caspase Assay Kit可用于流式檢測，Image-iT® LIVE Caspase Detection Kit則可用于成像。

圖7. 使用Vybrant® FAM Caspase Assay Kit的原理及檢測結(jié)果示例。

CellEvent® Caspase-3/7 Green檢測試劑是一種適用于活化的 caspase-3/7的新型熒光底物，可用于活細胞及固定細胞成像，最大吸收/發(fā)射波長約為 502/530 nm。該產(chǎn)品是一個與核酸結(jié)合染料相連的四個氨基酸多肽(DEVD)，在凋亡細胞中，caspase-3/7 活化后，DEVD 肽被切斷，使染料能夠與DNA 結(jié)合，并產(chǎn)生明亮的熒光。CellEvent® 試劑適用于成像(圖8)、高內(nèi)涵篩選和流式細胞術(shù)。

圖8. 細胞凋亡的多色成像。使用 30 μM 依托泊苷處理U2OS細胞18小時，誘導細胞凋亡。首先采用7.5 μM CellEvent® Caspase-3/7 Green 檢測試劑(C10423，綠色熒光)對處理細胞進行染色，檢測細胞凋亡，用Hoechst 33342核酸染料(H3570，藍色熒光)標記細胞核，然后用 150 nM MitoTracker® Deep Red FM (M22426，粉色熒光) 標記線粒體。經(jīng)固定和透化處理后，采用Alexa Fluor® 546鬼筆環(huán)肽(A22283，橙色熒光)標記肌動蛋白。

3.2 PARP蛋白質(zhì)水解

在凋亡過程中，ICE家族成員如caspase-3及caspase-7會將PARP裂解而產(chǎn)生85 kDa和25 kDa的片段。RARP裂解是細胞凋亡中最典型的特征之一。Anti-PARP FITC Apoptosis Kit包含了具FITC結(jié)合物的anti-PARP抗體，能專一性辨識裂解后的PARP所產(chǎn)生的85 kDa (p85)片段，而排除完整全長的PARP蛋白。細胞可利用流式細胞儀加以分析，并以陽性FITC染色檢測正處于細胞凋亡過程的細胞百分比。

4.1 染色質(zhì)固縮

在凋亡細胞中，核染色質(zhì)固縮的情形會增加，這些壓縮的細胞核經(jīng)部分核染料標記后，會呈現(xiàn)高度熒光狀態(tài)。Hoechst33342為可經(jīng)UV激發(fā)的核酸染料，能輕易地被所有細胞吸收。此染料的藍色熒光在凋亡細胞的的濃縮細胞核中格外明亮。相比之下，PI僅能進入細胞膜受損的細胞。同時使用這兩種染料，便能以流式細胞儀或熒光顯微技術(shù)獲得的染色結(jié)果區(qū)別健康細胞、凋亡細胞及壞死細胞。

圖9. Jukat細胞經(jīng)10 μM 喜樹堿處理4小時(右圖)或未處理(左圖)后，用流式細胞儀進行分析。經(jīng)喜樹堿處理后的細胞具有更高比例的凋亡細胞。L=活細胞, D=死細胞, A=凋亡細胞。

4.2 TUNEL檢測

細胞凋亡過程中發(fā)生的DNA片段化會導致DNA鏈斷裂。TUNEL檢測(terminal deoxynucleotidyl transferase dUPT nick end labeling)則廣泛應用于檢測凋亡細胞中的DNA缺口。DNA片段化是檢測細胞凋亡末期階段最可靠的方法之一，DNA片段經(jīng)核酸酶裂解或造成切口后，會暴露出大量的3’-羥基端。這些末端接著通過TUNEL技術(shù)以BrdUTP及terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)加以標記。一旦嵌入DNA后，BrdU便能利用標有Alexa Fluor® 488或FITC的anti-BrdU抗體進行檢測。