中藥材黃曲霉素檢測技術(shù)概述

 

中藥材是中醫(yī)防病治病的重要基礎(chǔ)。中藥材在田間生長、采收加工、儲藏運(yùn)輸?shù)雀鱾�環(huán)節(jié)都會因污染霉菌而發(fā)生霉變。這些霉菌分泌的有毒代謝產(chǎn)物使中藥材發(fā)霉變質(zhì)，直接威脅到群眾的用藥安全。中藥中的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素，赭曲霉素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏馬毒素等。中藥材的種類是影響真菌毒素污染的主要因素,易污染的中藥材,在不同的溫、濕度條件下均可產(chǎn)生真菌毒素。溫度和濕度條件也可以影響真菌毒素的增長,如：黃曲霉毒素在不同的溫、濕度條件下均可以產(chǎn)生；赭曲霉毒素需要在濕度較高的條件下才能產(chǎn)生。

 

近年來,隨著中藥材在國際市場上的持續(xù)升溫,其安全性越來越引起人們的關(guān)注。真菌毒素殘留作為中藥材微量外源性有毒有害物質(zhì),一般不表現(xiàn)出急性毒性,但通常有較強(qiáng)的蓄積性,致癌、致畸、致突變作用明顯,嚴(yán)重影響中藥材的安全性。

 

 

近年來，各級食品藥品監(jiān)管部門不斷加大中藥監(jiān)管力度，努力保持中藥質(zhì)量總體穩(wěn)定。

 

國家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于規(guī)范中藥生產(chǎn)經(jīng)營秩序嚴(yán)厲查處違法違規(guī)行為的通知（國食藥監(jiān)安[2012]187號文件）中，要求加強(qiáng)對黃曲霉毒素、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量等安全性指標(biāo)的檢測和控制，切實(shí)保證中藥材質(zhì)量和安全，另要求企業(yè)具備與生產(chǎn)品種相適應(yīng)的檢驗(yàn)設(shè)備和能力，嚴(yán)把質(zhì)量檢驗(yàn)關(guān)。

 

《國家藥品安全“十二五”規(guī)劃》，規(guī)劃中明確指出“開展藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)研究，搭建檢驗(yàn)技術(shù)共享平臺”、“加快推進(jìn)藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)在基層的應(yīng)用，配置快速檢驗(yàn)設(shè)備”，“加強(qiáng)縣級機(jī)構(gòu)快速檢驗(yàn)?zāi)芰�建設(shè)”的要求。

 

 

國家食品藥品監(jiān)督管理局對柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠(yuǎn)志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味藥材及其飲片品種項(xiàng)下增加“黃曲霉毒素”檢查項(xiàng)目，限度為“黃曲霉毒素B1不得過5 μg/kg；黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2總量不得過10 μg/kg”。

 

2010 版《藥典》附錄IX V 黃曲霉毒素測定采用高效液相色譜法，另外增補(bǔ)藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學(xué)衍生法。

 

免疫親和柱-高效液相色譜法：符合2010版《藥典》附錄IX V中黃曲霉毒素測定高效液相色譜法，另外增補(bǔ)藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學(xué)衍生法。

1.   設(shè)備和耗材配置　　

2. 樣品前處理:普瑞邦為中藥材提供不同的處理方案(詳細(xì)方案請聯(lián)系普瑞邦，普瑞邦開發(fā)了針對多種中藥材基質(zhì)提供優(yōu)化的處理方案)

3. 免疫親和柱凈化:

富集--洗滌--洗脫--收集全部洗脫液供化學(xué)衍生檢測用。

為什么使用光化學(xué)衍生器？ 由于黃曲霉具有較強(qiáng)的紫外吸收和產(chǎn)生熒光的特性，因此可以進(jìn)行HPLC-紫外或熒光檢測，但是同時黃曲霉毒素中的B1、G1 由于其在含水的流動相中容易產(chǎn)生熒光淬滅，因此在很多的實(shí)驗(yàn)中都會采用衍生法測定黃曲霉毒素。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在線的，由于在線的柱后光化學(xué)衍生有明顯的優(yōu)勢，所以現(xiàn)在被增補(bǔ)為藥典的檢測方法，優(yōu)勢主要在于無需任何化學(xué)試劑、對人員無傷害；無需人員直接操作、避免誤差; 無需擔(dān)心衍生液腐蝕檢測器。

Pribolab(普瑞邦)推出的PriboFast^R黃曲霉毒素總量試劑盒具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用于大量樣本的定量分析。

采用直接競爭酶聯(lián)免疫法，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素抗原，加入樣本（或黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液）及辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素特異抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的抗原與預(yù)包被在板孔上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣品吸光值與其所含黃曲霉毒素總量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中黃曲霉毒素總量的含量。

3. 樣本前處理：中藥材：粉碎、提取、離心，取上清液加入PriboSpin離心小柱進(jìn)行凈化。

為什么要用PriboSpin離心小柱？中藥材的基質(zhì)復(fù)雜，提取時樣本液顏色較深，而且不容易去除。有機(jī)試劑提取凈化方法繁瑣，試劑揮發(fā)對環(huán)境及人體造成危害，且凈化效果不穩(wěn)定。用PriboSpin離心小柱，則只需提取液離心過柱，即可去除提取液中的雜質(zhì)，方便快捷，凈化效果好，且回收率可以達(dá)到85%以上。

4.1 免疫反應(yīng)30min；洗板5次；顯色反應(yīng)30min；終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀OD值。

用酶標(biāo)儀判讀結(jié)果。

 

Pribolab(普瑞邦)推出的PriboStrip^TM黃曲霉毒素總量免疫金標(biāo)快速檢測條特異性好，適用于檢測樣本量大；短時間出具檢測結(jié)果并控制經(jīng)費(fèi)的情況，可以快速定性，初篩。

黃曲霉毒素總量快速檢測條應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理，樣本中的黃曲霉毒素總量在酶標(biāo)孔中與膠體金標(biāo)記的特異性抗黃曲霉毒素單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測線上AF－BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。如果樣本中黃曲霉素總含量大于0.5 ug/L，檢測線不顯顏色，結(jié)果為陽性；反之，檢測線顯紅色，結(jié)果為陰性。

3.   分析步驟：中藥材粉碎溶解后取上清液檢測。吸取樣品滴加到加樣孔中，8-15分鐘讀取結(jié)果。在C線顯色的情況下：T 線顯色比C線深或一樣深是陰性。T 線顯色比C線淺，或無顯色是陽性結(jié)果。

 

1. 中藥中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將中藥貯存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。

2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員，必須注意防護(hù)，如穿戴隔離衣帽，在進(jìn)行真菌分離培養(yǎng)工作時，應(yīng)戴口罩，并盡量防止孢子飛揚(yáng)。

3. 操作臺面如有漏濺，應(yīng)立即用新配的5％次氯酸鈉消毒。以5％次氯酸鈉（NaOCl）處理時，黃曲霉毒素于數(shù)秒鐘內(nèi)即被破壞，故是常用的消毒劑。

4. 也有應(yīng)用生物學(xué)方法解毒的報(bào)道，生物學(xué)方法成本低，收效大，可能是一種有前途的除毒措施。

鑒于霉菌毒素對人體的危害，提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護(hù)自身安全哦！