熒光顯微成像在生物分析中的應(yīng)用

論文摘自山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院，濟南 250014

摘 要 熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統(tǒng)可獲取顯微熒光成像及微區(qū)熒光光譜、熒光壽命的測定信息，廣泛應(yīng)用于細胞、組織中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能分析，核酸的識別檢測，金屬離子、自由基的定量測定，以及納米生物探針的研制等生物分析研究的熱點領(lǐng)域。

1 引 言
熒光顯微鏡在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用，是觀測細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命現(xiàn)象的有力工具。熒光顯微鏡作為一種必不可少的分析手段，常用于定性觀察細胞內(nèi)部熒光物質(zhì)的空間分布和強度分布，得到細胞的熒光圖像，研究細胞的結(jié)構(gòu)。然而熒光顯微鏡不能定量給出圖像發(fā)光的強度數(shù)值，無法研究細胞圖像發(fā)光強度變化不大或熒光物質(zhì)空間分布變化細微的生理過程。因此，隨著生物醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，迫切需要有更高靈敏度，操作更快捷，功能更加完備的儀器來滿足生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究發(fā)展的要求。熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合而成的系統(tǒng)儀器能夠獲取顯微熒光成像及微區(qū)熒光強度、熒光壽命的測定信息。選擇熒光探針對被標記物進行特異性標記，熒光探針的亮度即熒光強度可反映被標記物相對含量的多少。熒光顯微鏡對圖像采集后，熒光光譜儀可測量圖像的熒光強度，對獲取的圖像進行熒光強度的定量，為全面分析和研究細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供更加詳盡的數(shù)據(jù)信息。

2 熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統(tǒng)及特點
應(yīng)用單臂光纖連接熒光顯微鏡與熒光光譜儀，實現(xiàn)熒光光譜測量和細胞實時成像二維信號的同時采集。以高頻脈沖激光器作為激發(fā)光源激發(fā)顯微鏡下樣品，使之發(fā)射出可見范圍內(nèi)的波長，呈現(xiàn)熒光映像。用熒光顯微鏡的物鏡收集信號，通過單臂光纖將耦合好的熒光信號從熒光顯微鏡傳導(dǎo)至熒光光譜儀，記錄熒光發(fā)射光譜。電感耦合相機（charged coupled device，CCD）攝像系統(tǒng)作為光電傳感器用于顯微鏡圖像獲取技術(shù)采集細胞圖像，并將圖像信號轉(zhuǎn)換成電信號輸入計算機進行數(shù)據(jù)讀取及圖像處理，獲取微區(qū)熒光光譜掃描譜圖的詳細信息，并對圖像進行采集、曝光調(diào)整、多色彩空間的影像編輯、預(yù)定義的影像設(shè)置、自動調(diào)焦、自動后處理加工調(diào)整，獲得色彩鮮艷、清晰度高的影像。應(yīng)用光纖耦合熒光光譜儀與熒光顯微鏡，配合熒光圖像掃描顯微熒光光譜及進行微區(qū)熒光壽命的測定（超高時間分辨率，可得到復(fù)合物中不同組分的熒光壽命），優(yōu)化升級了作為單一儀器的功能。紅敏光電倍增管（PMT）和紅外PMT 切換使用滿足超寬光譜范圍探測（200 ～1700 nm），適合從紫外到近紅外波段熒光光譜的特性研究，為生物體系中近紅外熒光探針的開發(fā)應(yīng)用研究提供了有力的支持。

3 生物分析中的應(yīng)用
熒光探針是設(shè)計用來進行生物標本特定區(qū)域內(nèi)定位或?qū)μ囟ù碳し磻?yīng)的熒光團，可以高度敏感性和選擇性的檢測復(fù)雜生物分子及活細胞中的特定成分。相對于常規(guī)熒光檢測而言，在近紅外光區(qū)，生物基體光吸收或熒光強度很小，且致密介質(zhì)（如組織）的光散射明顯降低，激發(fā)光的穿透性更強，因而自發(fā)熒光的背景干擾顯著降低。熒光探針由于其特殊的光物理和光化學(xué)特性而具有靈敏度高、動態(tài)響應(yīng)范圍寬的優(yōu)點，且其測定條件適宜生命體的生理環(huán)境而被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。設(shè)計近紅外熒光探針引入組織和細胞，富集在組織和細胞的特定成分中，在熒光顯微鏡下不僅可觀察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞的結(jié)構(gòu)、生物大分子等進行實時觀察和檢測，配合熒光光譜儀獲取熒光圖像的量化信息。因此，熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統(tǒng)在生物分析領(lǐng)域中將具有廣泛的應(yīng)用前景。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能分析及核酸的識別檢測

生物體內(nèi)細胞的生理狀態(tài)受內(nèi)部和外部因素的影響，可通過基因表達和后續(xù)的蛋白質(zhì)表達表現(xiàn)出來。因此，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究是認識生命過程的關(guān)鍵。活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的顯微熒光成像分析是生物顯微技術(shù)的一個重要方面。Dawn 等成功設(shè)計合成了活細胞中定點標記N 端為半胱氨酸蛋白質(zhì)的一系列熒光分子探針。這種熒光分子探針利用生理條件下含硫代酸酯的小分子可有效穿過細胞膜與 N 端為半胱氨酸的蛋白質(zhì)進行化學(xué)選擇性反應(yīng)產(chǎn)生熒光，跟蹤檢測蛋白質(zhì)的功能及相互作用。利用熒光顯微鏡觀察了探針標記細胞的顯微熒光成像，根據(jù)熒光光譜確定探針的發(fā)射波長處于近紅外波段，適用于活細胞中蛋白質(zhì)的熒光成像分析檢測。

生命活動離不開酶的催化作用，機體內(nèi)的物質(zhì)代謝在酶的催化下有條不紊地進行。酶是由活細胞合成的，是能夠?qū)μ禺惖孜锲鸶咝Т呋�作用的蛋白質(zhì)。基于熒光的酶分析方法隨著酶熒光探針的開發(fā)得以廣泛應(yīng)用，熒光顯微鏡常用于檢測熒光酶細胞化學(xué)的作用。為了研究某些細胞內(nèi)的生理過程，經(jīng)常將熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）與熒光顯微技術(shù)結(jié)合起來。Mupam 等就通過熒光顯微鏡、CCD 和熒光光譜儀來進行完整細胞中 FRET 發(fā)生的定位，將細胞內(nèi)的理化反應(yīng)研究提高到細胞器的水平。Chi-wang等利用 FRET 工作原理設(shè)計的熒光探針包括一個對已知蛋白激酶特異性識別的底物結(jié)構(gòu)域，一個與磷酸化絲氨酸底物結(jié)構(gòu)相結(jié)合的磷酸化識別結(jié)構(gòu)域。當?shù)孜锝Y(jié)構(gòu)被磷酸化后，分子內(nèi)部就會發(fā)生磷酸化識別結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合而引起的內(nèi)部折疊，探針兩端兩個熒光蛋白相互靠近就會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。熒光光譜提供分子發(fā)生磷酸化前后的熒光強度變化，熒光顯微鏡獲得 FRET 成像反映供體蛋白與受體蛋白之間的相互作用，做到活細胞內(nèi)定時、定量、定位地觀測蛋白激酶活性變化。

核酸是生命的信息物質(zhì)，對蛋白質(zhì)的合成、細胞分裂和復(fù)制以及生物遺傳起著重要作用。熒光探針技術(shù)具備方法簡便，靈敏度高等優(yōu)點，結(jié)合熒光顯微鏡應(yīng)用于核酸的定量分析、結(jié)構(gòu)及作用機理的研究日益廣泛。分子信標作為敏感、特異的核酸探針，通過空間結(jié)構(gòu)改變決定發(fā)射熒光特性，實現(xiàn)活細胞中核酸的定位信息采集及定量檢測，利用分子信標技術(shù)可以對生物大分子在活體內(nèi)的代謝等動態(tài)過程進行跟蹤分析。Santangelo 等設(shè)計了一對與待測目標 mRNA 序列互補的新型分子信標，制成脂質(zhì)體使之攝入細胞，與目標 mRNA 雜化時產(chǎn)生 FRET，較之單一分子信標有效抑制了主動錯誤信息的檢出，靈敏定量檢測目標 mRNA。應(yīng)用顯微注射法注入活體細胞獲取熒光顯微成像，檢測熒光強度實時反映活體 RNA 的代謝轉(zhuǎn)移過程。(更多信息請訪問精譜徠官網(wǎng)）