開發(fā)用于分離和純化的聚焦梯度

 

Jo-Ann M. Jablonski、Thomas E. Wheat and Diane M. Diehl；

Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

用于進(jìn)行分離和純化的色譜分離方法與分析型分離方法受到相同物理和化學(xué)原理的制約。然而，在制備型試驗(yàn)中，科學(xué)家通常在大型柱上和高質(zhì)量負(fù)載下分離化合物，并需要更高的分離度以提高所收集組分的純度和回收率。雖然設(shè)計(jì)更緩的梯度是提高分離度的一種較好的首選方法，但改變整個(gè)分離過(guò)程的梯度斜率可導(dǎo)致峰寬加大和總運(yùn)行時(shí)間增加�？商娲�普通更緩梯度的聚焦梯度僅對(duì)需要增加分離度的色譜圖部分減小梯度斜率，從而可在不增加總運(yùn)行時(shí)間的情況下提高對(duì)洗脫時(shí)間接近的色譜峰的分離度。聚焦梯度可根據(jù)搜索運(yùn)行或者直接從第一次制備運(yùn)行進(jìn)行定義。

 

梯度開發(fā)步驟

■ 確定制備規(guī)模的系統(tǒng)體積

■ 運(yùn)行搜索梯度

■ 設(shè)計(jì)聚焦梯度

■ 在制備柱上運(yùn)行聚焦梯度

 

儀器

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世 2525型二元梯度模塊、2767型樣品管理系統(tǒng)、系統(tǒng)流路組織器、2996型光電二極管陣列檢測(cè)器、

AutoPurification™流通池

色譜柱： XBridge™制備型OBD™ C18柱19 x 50 mm、5μm（貨號(hào)186002977）

流速： 25mL/分鐘

流動(dòng)相A： 0.1%的甲酸水溶液

流動(dòng)相B： 0.1%甲酸-乙腈溶液

波長(zhǎng)： 260 nm

 

磺胺: 10 mg/mL

磺胺噻唑: 10 mg/mL

磺胺二甲嘧啶: 20 mg/mL*

磺胺甲二唑: 10 mg/mL

磺胺甲唑: 10 mg/mL

磺胺二甲異唑: 4 mg/mL

總濃度: 64 mg/mL（溶于二甲基亞砜）

*選定用于聚焦梯度的色譜峰

 

確定制備規(guī)模的系統(tǒng)體積

■ 取下色譜柱并更換成兩通。

■ 流動(dòng)相A使用乙腈，流動(dòng)相B使用包含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈（解決了非加成性混合和粘滯問(wèn)題）。

■ 在254 nm下進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

■ 采集100% A的基線數(shù)據(jù)5分鐘。

■ 在5.01分鐘時(shí)，將梯度設(shè)置為100% B并再采集5分鐘數(shù)據(jù)。

■ 測(cè)定100% A和100% B之間的吸光度差異。

■ 計(jì)算存在50%吸光度差異時(shí)的時(shí)間。

■ 計(jì)算步驟開始時(shí)（5.01分鐘）和50%時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間差異。

■ 將時(shí)間差異乘以流速。

 

系統(tǒng)體積被定義為從梯度形成點(diǎn)到色譜柱前端的體積。系統(tǒng)體積用于聚焦梯度的設(shè)計(jì)。如圖1所示，本試驗(yàn)所用儀器配置下的系統(tǒng)體積是3.0 mL。

 

在2.47分鐘洗脫3號(hào)色譜峰的溶劑濃度在較早的時(shí)間點(diǎn)上形成。如圖3所示，檢測(cè)器和梯度形成點(diǎn)之間的偏移量等于系統(tǒng)體積加上柱體積。用于這臺(tái)特定系統(tǒng)的偏移量等于早期確定的3 mL系統(tǒng)體積再加上19 x 50 mm制備柱的體積（11.9 mL），即14.9 mL。在25 mL/分鐘的流速下，溶劑濃度到達(dá)檢測(cè)器需要0.59分鐘。2.47分鐘的洗脫時(shí)間減去0.59分鐘的偏移時(shí)間等于1.88分鐘。由于初始大規(guī)模梯度有0.39分鐘的保留時(shí)間，因此形成洗脫色譜峰的乙腈百分比的時(shí)間是1.88分鐘減去0.39分鐘，即1.49分鐘。

 

計(jì)算在2.47分鐘洗脫色譜峰的乙腈百分比。原始大規(guī)模梯度在5分鐘內(nèi)洗脫 5-50% B，最初梯度的駐留時(shí)間為0.39分鐘。

 

根據(jù)在2.47分鐘洗脫出色譜峰的梯度計(jì)算得到的乙腈百分比是13.4%，但由于梯度開始于5%乙腈，因此洗脫該峰的乙腈實(shí)際濃度是13.4% + 5%，或者說(shuō)18.4%乙腈。

 

旨在分離梯度中部洗脫時(shí)間接近的色譜峰的聚焦梯度應(yīng)開始于原始小規(guī)模試驗(yàn)條件，通常為0-5% B。進(jìn)樣開始后立即將梯度快速增加至比能洗脫目標(biāo)峰的預(yù)期乙腈百分比濃度低5%的乙腈百分比。在搜索梯度中所用的1/5斜率下繼續(xù)進(jìn)行緩的聚焦梯度部分。預(yù)計(jì)一個(gè)五倍的更緩梯度可為洗脫時(shí)間接近的色譜峰提供更高的分離度。終止高出可洗脫目標(biāo)峰的預(yù)期乙腈百分比濃度5%的聚焦梯度部分。原始梯度在5分鐘內(nèi)洗脫5-50% B，或者說(shuō)在5分鐘內(nèi)梯度變化45%。這樣，乙腈濃度每分鐘變化9%（從9%-10%左右簡(jiǎn)化得到）。然后，新的梯度斜率應(yīng)為10%的1/5，或者說(shuō)每分鐘變化2%。10%的乙腈濃度改變通過(guò)每分鐘變化2%而達(dá)到，說(shuō)明用于分離3號(hào)和4號(hào)峰的聚焦梯度時(shí)間片段應(yīng)持續(xù)5分鐘。一旦梯度的聚焦部分完成，乙腈百分比快速增加至95% B，以清洗色譜柱。平衡色譜柱后，終止初始條件下的梯度。5-45% B = 每分鐘9%（舍入至每分鐘10%）梯度斜率每分鐘變化2%。

聚焦梯度可明顯提高圖4所示色譜圖中3號(hào)峰和4號(hào)峰的分離度。5號(hào)峰和6號(hào)峰因受到梯度聚焦部分的影響而出現(xiàn)移位，梯度部分繼續(xù)在較緩的斜率下洗脫化合物，直至設(shè)定用于進(jìn)行柱清洗的較高百分比的乙腈進(jìn)入色譜柱。較緩的聚焦梯度能在不增加運(yùn)行時(shí)間的情況下對(duì)天然混合組分提供更高的分離度，因而使色譜分析師能夠獲得更純的產(chǎn)物和更好的回收率。

 

當(dāng)科學(xué)家為后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)物純化時(shí)，需要在高質(zhì)量負(fù)載下分離化合物。聚焦梯度可在不增加運(yùn)行時(shí)間的情況下提高對(duì)洗脫時(shí)間接近色譜峰的分離度，從而改善分離效果。系統(tǒng)體積信息可以對(duì)制備型梯度進(jìn)行直接優(yōu)化。使用聚焦梯度可提高產(chǎn)物產(chǎn)率和純度，同時(shí)不會(huì)增加溶劑消耗量和廢液生成量。聚焦梯度方法可實(shí)現(xiàn)分離，因而有助于控制純化成本。

 

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