VEGF ELISA試劑盒
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前言說明
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種同型二聚體蛋白,最初人們是從富含正常牛垂體濾泡星形蛋白細胞的基質(zhì)中分離純化得到,由各種血管組織分泌。后來人們發(fā)現(xiàn)VEGF與一種血管通透因子(VPF)相同, VPF是之前在富含腫瘤細胞系的基質(zhì)中鑒別得到的,腫瘤細胞可以提高毛細血管的通透性。據(jù)報道,VEGF的活性包括促進內(nèi)皮細胞的生長,促進血管的生成和提高毛細血管的通透性。VEGF是一種分子量為38.2kDa的同型二聚體,它由兩條含165個氨基酸的多肽鏈組成。多數(shù)人腫瘤細胞都會分泌VEGF,包括:人肺腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、纖維肉瘤、HL60早幼粒細胞性白血病、GS-9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤和U937淋巴瘤細胞。一些正常的組織也會分泌VEGF,如:活化的巨噬細胞、角質(zhì)化細胞、肝細胞、平滑肌細胞、間質(zhì)細胞、胚胎成纖維細胞、支氣管及脈絡(luò)叢上皮細胞,腎小球內(nèi)臟上皮及其系膜細胞。IBL公司的人VEGF ELISA試劑盒可用于人EDTA血漿和細胞培養(yǎng)上清中VEGF的定量檢測。
實驗原理
此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒,使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑,最終溶液所顯示的顏色強度與樣品中VEGF的量成正比。
測定范圍
15.63~1000pg/ml (第一次溫育:37℃下溫育60min)
7.81~500pg/ml (第一次溫育:4℃下溫育過夜)
預(yù)期用途
此試劑盒可用于人EDTA血漿和細胞培養(yǎng)液上清EGF的體外定量檢測。此試劑可識別天然的和重組的VEGF。利用夾心法的酶聯(lián)免疫吸附實驗,采用用了高特異性的多克隆抗體和單克隆抗體。
試劑盒成分
1) 包被板:微孔中包被了抗人VEGF-1(16F1)的鼠IgG單克隆抗體,96孔。
2) 濃縮型酶標抗體:HRP標記的抗人VEGF-1兔IgG Fab片段,30倍濃縮,0.4ml
3) 標準品:內(nèi)含重組的人VEGF 165,0.5ml×2
4) EIA緩沖液:1%的BSA,含0.05%的吐溫的PBS,30ml
5) 酶標抗體稀釋液:內(nèi)含的1%BSA、0.05%吐溫20的PBS,12ml
6) 顯色劑:TMB底物液,15ml
7) 終止液:1N的H2SO4,12ml
8) 濃縮洗滌液:內(nèi)含0.05%吐溫的磷酸緩沖液(40倍濃縮),50ml。
實驗所需器材但試劑盒不提供
l 酶標儀(450nm)
l 帶刻度的量筒與燒杯
l 孵箱(37℃±1℃)
l 吸水紙
l 冰箱(4℃)
l 試管
l 微量移液器和取樣吸頭
l 去離子水
l 坐標紙(log/log)
l 用于稀釋標準品的試管
l 洗滌瓶
試劑準備
1. 洗滌緩沖液制備:先將洗滌濃縮液平衡至室溫,充分混勻,然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻,即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi),并于2周內(nèi)使用
2. 標記抗體的制備:用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍,即得。
例:如果只測一條板,8孔,則需要標記抗體800ul(30ul的標記抗體+870ul的標記抗體稀釋液,混勻,使用時每孔加100ul)
此步驟在實驗前完成
剩余的標記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi),保存在4℃
3. 標準品的制備:吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內(nèi),充分混勻,得到2000pg/ml的人VEGF標準品
4. 標準品的稀釋:準備8個試管用于標準品的稀釋,每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 1000pg/ml
2號管 500pg/ml
3號管 250pg/ml
4號管 125pg/ml
5號管 62.5pg/ml
6號管 31.25pg/ml
7號管 15.63pg/ml
8號管 0pg/ml(試驗樣品空白)
吸取230ul的標準品于1號管混勻,然后從1號管吸取230ul加入2號管,依次連續(xù)稀釋,標準品范圍為1000~15.63pg/ml
5. 樣品稀釋:樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有估計,我們建議,先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測,來確定樣品的最佳稀釋比例
實驗步驟
使用前,所有樣品應(yīng)平衡至室溫,大約30min,然后充分混勻,確保試劑質(zhì)量無變化,標準曲線和樣品檢測同時進行
試劑 |
檢測樣品 |
標準品 |
檢測樣品對照孔 |
試劑對照孔 |
檢測樣品100ul |
稀釋標準品(1-7管)100ul |
EIA緩沖液(第8管) 100ul |
EIA緩沖液100ul |
蓋板,37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜 |
洗板7次 |
酶標抗體 |
100ul |
100ul |
100ul |
- |
蓋板,4℃下溫育30min |
洗板9次 |
顯色劑 |
100ul |
100ul |
100ul |
100ul |
室溫避光溫育30min |
終止液 |
100ul |
100ul |
100ul |
100ul |
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值 |
1) 確定好空白對照孔,并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2) 確定好樣品對照孔,檢測樣品孔和標準品孔,然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品加入到相應(yīng)的微孔中。
3) 蓋板,37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜
4) 用洗滌瓶洗板,在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒,棄取洗滌液。重復(fù)7次,最后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時,用洗板機洗四次后,在用洗滌瓶洗3次。
5) 每孔加100ul酶標抗體,除試劑空白對照孔外
6) 蓋板,4℃下溫育30min
7) 按照步驟4)洗板9次
8) 將所需量的顯色劑加入到試管中,然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染,請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9) 室溫避光溫育30min,加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10)在每孔加100ul終止液,此時溶液顏色會變成黃色。
11) 擦去微孔板底部的污點或水滴,終止液加入后30min內(nèi),在酶標儀450nm處讀數(shù)
特別注意
1. 試驗樣品采集后應(yīng)立即檢測,凍存的樣品避免反復(fù)凍融,檢測前應(yīng)先將其完全溶解混勻
2. 試驗樣品用EIA緩沖液稀釋
3. 試驗樣品和標準品應(yīng)做雙份檢測
4. 試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍,有機溶劑的污染可能會影響檢測
5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板,否則會導(dǎo)致試驗失敗
6. 吸水紙上拍干微孔板,不能擦拭
7. TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處,因其對光敏感,且避免接觸金屬
8. 加入終止液后30min內(nèi)必須酶標儀讀數(shù)
9. 肝素血漿樣品的檢測值低于EDTA血漿樣品
結(jié)果計算
繪制曲線前,所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗樣品空白值,包括標準品和未知的樣品。以標準品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線,從標準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
附:采用全自動酶標儀檢測,只需檢測前設(shè)置好酶標儀的相關(guān)參數(shù),如坐標參數(shù)(線性,半對數(shù))和計算方式參數(shù)(三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程),即可直接得到結(jié)果
本譯文僅供參考,詳情請以原文為準。
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