精制百日咳白喉破傷風(fēng)疫苗之制造及鑒定

（日本社團(tuán)法人北里研究所 生物制劑研究部 2006年）

1.精制無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗原液
  將各項(xiàng)培養(yǎng)基成份預(yù)稱好倒入tank內(nèi)加水?dāng)嚢璩浞秩芙夂�，將PH調(diào)至適當(dāng)范圍，121℃滅菌。將滅菌后之培養(yǎng)基分瓶、接種Bordetella pertussis （strain Tohama Phase I）菌35℃培養(yǎng)。收集菌液（須進(jìn)行pH、HA、FHA測(cè)試），用硫酸氨（Ammonium sulfate）沉淀，用高濃度鹽抽出，經(jīng)蔗糖梯度離心分離純化2次，第1次分離后進(jìn)行HA測(cè)試、蛋白質(zhì)含量測(cè)試、免疫沉淀（FHA、PT），第2次分離后除上述三項(xiàng)測(cè)試外，加測(cè)LAL試驗(yàn)。再加福爾馬林于35℃、5周不滅活處理后作為batch原液（須進(jìn)行蛋白氮含量試驗(yàn)、染色試驗(yàn)、無(wú)菌試驗(yàn)、滅活試驗(yàn)、易熱性毒素否定試驗(yàn)、小鼠體重減少試驗(yàn)、小鼠白血球數(shù)增加試驗(yàn)、Histamine增感試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)）。
 
2.白喉類毒素原液
  將白喉?xiàng)U菌接種于Loeffer Medium（斜面培養(yǎng)基），移種一次于Loeffer Medium，再移植至液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，然后用培養(yǎng)基增值、振蕩培養(yǎng)、接著大量接種培養(yǎng)于6支20公斤瓶中，其培養(yǎng)基在接種前加入無(wú)菌過(guò)濾之maltose。收集培養(yǎng)液，須進(jìn)行染色試驗(yàn)（確認(rèn)無(wú)雜菌）及毒素力價(jià)Lf測(cè)定（此時(shí)約250Lf/Ml）。離心除菌，將毒素液無(wú)菌過(guò)濾、超濾（MW30,000）、用硫酸氨（Ammonium sulfate）沉淀、回收、限外超濾（MW100,000），再加福爾馬林于33-35℃、4-6周滅活處理（此時(shí)約500Lf/mL，須進(jìn)行豚鼠及兔子之無(wú)毒化試驗(yàn)）精制。過(guò)濾后作為batch原液（須進(jìn)行純度試驗(yàn)、內(nèi)毒素含量試驗(yàn)、完全性試驗(yàn)、Lf測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、無(wú)毒化試驗(yàn)（豚鼠及兔子）、小鼠體重減少試驗(yàn)、白喉類毒素交叉否定試驗(yàn)）。

3.破傷風(fēng)類毒素原液
  將破傷風(fēng)梭菌接種于培養(yǎng)基在35℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)液（須進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、染色試驗(yàn)，確定無(wú)雜菌）、過(guò)濾（須進(jìn)行Lf測(cè)定pH測(cè)定），過(guò)濾后膜作完整性試驗(yàn)。限外過(guò)濾、用硫酸氨（Ammonium sulfate）沉淀精制、離心、通膠質(zhì)colum分離（分子量分離）過(guò)濾，此時(shí)須進(jìn)行毒素力價(jià)Lf測(cè)定（約1,500~~2,000Lf/mL）。再加福馬林于35℃、5周滅活處理，作為破傷風(fēng)類毒素原液（須進(jìn)行純度試驗(yàn)、Lf測(cè)定、蛋白氮含量試驗(yàn)、無(wú)菌試驗(yàn)、滅活試驗(yàn)、小鼠體重減少試驗(yàn)、破傷風(fēng)類毒素交叉否定試驗(yàn)）。

4.中間原液
  將精制百日咳疫苗原液、白喉類毒素原液、破傷風(fēng)類毒素原液混合，以鋁凝膠吸附，作為中間原液。此時(shí)須進(jìn)行pH試驗(yàn)、鋁含量試驗(yàn)、硫柳苯含量試驗(yàn)、甲醛含量測(cè)驗(yàn)、蛋白氮含量試驗(yàn)、無(wú)菌試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)、小鼠體重減少試驗(yàn)。

5.最終原液
  將中間原液稀釋，作成最終原液。

6.小分制品
  將最終原液分裝充填而成，此時(shí)須進(jìn)行pH試驗(yàn)、鋁含量試驗(yàn)、硫柳苯含量試驗(yàn)、甲醛含量測(cè)驗(yàn)、無(wú)菌試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)、小鼠體重減少試驗(yàn)、小鼠白血球數(shù)增加試驗(yàn)、Histamine增感試驗(yàn)、白喉類毒素?zé)o毒化試驗(yàn)、破傷風(fēng)類毒素?zé)o毒化試驗(yàn)、效價(jià)試驗(yàn)（吸附精制百日咳疫苗、吸附白喉類毒素、吸附破傷風(fēng)類毒素）、蛋白氮含量試驗(yàn)

7.國(guó)家鑒定