多肽抗生素研究進展

多肽抗生素研究進展
孫超　王暉　孫波　彭學賢

摘要　多肽抗生素是生物界中廣泛存在的一類生物活性小肽，一般具有抗細菌或真菌的作用，有些還具有抗原蟲、病毒或癌細胞的功能。按照化學結(jié)構的不同，多肽抗生素可分為5類：①具有螺旋結(jié)構的線性多肽；②富含某種氨基酸的線性多肽；③含有一個二硫鍵的多肽；④含有兩個或兩個以上二硫鍵的多肽；⑤羊毛硫抗生素。根據(jù)作用機理的不同，多肽抗生素又可分為裂解細胞膜的裂解肽和非裂解肽。多肽抗生素已經(jīng)開始用于醫(yī)藥、食品和植物抗病基因工程等方面，并且有著很大的發(fā)展?jié)摿Α?BR>
多肽抗生素是指相對分子質(zhì)量通常在1×104以下，具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)。但是由于區(qū)分小肽與蛋白質(zhì)的界限不很嚴格，不同學者對多肽抗生素的分子量上限有不同的觀點。最初，人們把這類具有抗菌活性的多肽稱為“antibacterial peptides”，中文譯為“抗菌肽”，其原意應為“抗細菌肽”。后來發(fā)現(xiàn)有些“抗細菌肽”還具有抗真菌等其它微生物的功能，便稱之為“antimicrobial peptides”。但是隨著研究的深入，人們相繼發(fā)現(xiàn)這類多肽還具有抗寄生蟲、病毒、癌細胞等功能，尤其是隨著這類多肽物質(zhì)在醫(yī)藥學上的應用，許多學者傾向于稱之為“peptide antibiotics”――“多肽抗生素”。也許是由于幾乎所有的多肽抗生素都具有抗細菌的功能，“抗菌肽”作為一個約定俗成的名稱，在國內(nèi)依然被廣泛采用。如果沒有特殊說明，本文中的多肽抗生素特指由基因編碼，在核糖體上合成的多肽抗生素。那些在代謝過程中通過酶促反應合成的多肽性質(zhì)的

多肽抗生素研究的真正興起是從20世紀80年代初開始的。1980年，Boman等人從美國天蠶蛹中分離得到了具有抗菌活性的多肽――cecropins，并于次年在《Nature》上公布了其氨基酸序列。同是在1980年，Lefur等人從兔的巨噬細胞中分離到了另一種多肽抗生素――defensins，并于3年后公布了其氨基酸序列。此后數(shù)年間，人們相繼從細菌、真菌，到兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物、直至人類體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了多肽抗生素。目前，僅昆蟲來源的多肽抗生素，就已達170余種。為了研究的方便，人們根據(jù)多肽抗生素的結(jié)構對它們進行了分類。

1　多肽抗生素的分類

1.1　具有螺旋結(jié)構的線性多肽　cecropins是第一個被發(fā)現(xiàn)的動物多肽抗生素，1980年，由Boman等從美國天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37～39個氨基酸殘基，不含半胱氨酸，其N端區(qū)域具有強堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結(jié)構，而在C端區(qū)域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，多數(shù)多肽的C端被酰胺化，酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。此后，人們相繼從家蠶、柞蠶、果蠅、麻蠅中分離到了cecropins類多肽抗生素。1989年，Lee等人從豬小腸中分離到了cecropin P1，說明了cecropins可能在動物中廣泛存在。cecropins對革蘭陽性菌、陰性菌都具有很強的殺傷力，而對真菌和真核細胞沒有毒性。目前cecropins已被人工合成并已商品化。
magainins也是較早發(fā)現(xiàn)的一類具有雙親螺旋結(jié)構的多肽抗生素。最初是從蟾蜍的皮膚中分離得到的,后來在哺乳動物的神經(jīng)組織和腸組織中發(fā)現(xiàn)了其類似物。magainins對革蘭陰性菌、陽性菌、真菌、原生動物都有殺傷作用，但是對革蘭陰性菌的活性比cecropins要低10倍左右。

此外，從一些動物的再生性器官和兩棲類的多種組織器官中分離得到了一些具有螺旋結(jié)構的多肽，如來源于南美蛙的dermaseptin和來源于樹蛙的bombininh。

1.2　富含某種氨基酸的線性多肽　apidaecins是從蜜蜂中分離得到的富含脯氨酸的多肽抗生素，一般含有16～18個氨基酸殘基，其中脯氨酸含量高達33％，精氨酸含量可達17％。其一級結(jié)構中具有PRP和PP的典型motifs。apidaecins對某些革蘭陰性菌具有很強的活性，而對革蘭陽性菌不起作用。apidaecins對某些革蘭陰性的植物病原菌和腸桿菌科的致病菌的高殺傷力，使其在植物抗細菌病基因工程和食品工業(yè)中有著很好的應用前景。

drosocin是來源于果蠅的一種富含脯氨酸的多肽抗生素，在結(jié)構上與apidaecin具有一定的相似性，但是在其11位的蘇氨酸羥基上連接著一個O-二糖鏈(-N-乙酰半乳糖胺-半乳糖)。

coleoptericin和hemiptericin分別來源于鞘翅目和半翅目昆蟲，一級結(jié)構中富含甘氨酸，分子量一般較大。Oppenheim等人從人的腮腺和下頜腺分泌物中分離得到了一組富含組氨酸的多肽抗生素，長度在7～38個氨基酸殘基不等，被稱為histatins。對于引起口腔感染的多種微生物具有活性。indolicidin是來源于牛中性粒細胞的多肽抗生素，因其13個氨基酸中含有5個色氨酸而得名。其C端是酰胺化的。對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有很強的殺菌活性。

1.3　含有一個二硫鍵的多肽　這是一類數(shù)量很少的多肽抗生素，第1個被發(fā)現(xiàn)的這類多肽是bactenecin，來源于牛中性粒細胞［5］。其12個氨基酸中含有4個精氨酸，在其第2位和第11位氨基酸殘基間形成二硫鍵。bactenecin對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有活性。

這類多肽中還包括一些來源于蛙類皮膚的多肽抗生素，一般在C端有一個由7個氨基酸形成的“l(fā)oop”和一個長的N端“尾巴”，如brevinin-1，brevinin-2。

1.4　含有兩個或兩個以上二硫鍵的多肽　這類多肽的典型代表是defensins，最初發(fā)現(xiàn)的α-defensins來源于哺乳動物的組織中，一般含有29～34個氨基酸殘基，其中6個保守的半胱氨酸形成3個分子內(nèi)二硫鍵，此外，其第6位和第15位的精氨酸，第24位的甘氨酸也是保守的。α-defensins可形成3層的β片層結(jié)構，通過3個二硫鍵和Arg-6與Glu-24之間的鹽橋而被穩(wěn)定。目前，defensins已被合成并已商品化。defensins對多種細菌和某些真菌具有殺傷作用，并且對真核細胞有一定的毒性。defensins對革蘭陽性菌的活性比革蘭陰性菌強。defensins的活性比cecropins弱，并且通常在低離子強度下起作用。

β-defensins比α-defensins大一些，一般含有38～42個氨基酸殘基。都含有3個二硫鍵和4～8個精氨酸。

昆蟲defensins在C末端與α-defensins相似，但是只有兩個β片層結(jié)構，中間有一段α螺旋起穩(wěn)定作用。主要對革蘭陽性菌起作用，而對真菌沒有作用。

植物defensins一般有45～54個氨基酸殘基，可形成4個二硫鍵，3個β片層結(jié)構和一個α螺旋結(jié)構。植物defensins一般只對真菌起作用而對細菌沒有作用。不同植物defensins對真菌的抗菌譜不同。

thionins也是一類來源于植物的多肽抗生素，含有45～47個氨基酸殘基，有6個或8個半胱氨酸形成的3個或4個二硫鍵。其二級結(jié)構可形成2個反平行的α螺旋結(jié)構和2個反平行的β片層結(jié)構。thionins抑制多種植物致病細菌和真菌，但是對假單孢菌屬和歐文氏菌屬的細菌不起作用。
1.5　羊毛硫抗生素　羊毛硫抗生素(lantibiotics)是指一些由細菌產(chǎn)生的，由基因編碼，在核糖體中合成，經(jīng)翻譯后加工而含有一些特殊有機基團的多肽抗生素。其中研究最廣泛的是nisin。它是來源于乳酸菌的一種多肽抗生素，成熟多肽由34個氨基酸組成，含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基團。主要對革蘭陽性菌起作用，而對革蘭陰性菌不起作用。已被廣泛應用作食品保鮮劑。nisin及其類似物在醫(yī)藥上的應用研究也正在進行。

2　多肽抗生素的生物學活性

2.1　多肽抗生素對細菌的殺傷作用　大多數(shù)多肽抗生素都具有抗細菌的作用。目前認為cecropins、magainins、defensins等許多可形成雙親螺旋結(jié)構的多肽抗生素是通過作用于細菌的細胞膜，在膜上形成離子通道，引起胞內(nèi)物質(zhì)的外漏而殺死細菌的。通過對sarcotoxinIA的研究發(fā)現(xiàn)，當在脂質(zhì)體中存在膽固醇時，sarcotoxinIA對其的裂解作用減弱。這可部分解釋這類多肽對真核細胞不起作用的原因。

apidaecins類多肽抗生素對細菌的作用機制是非裂解機制，可能是通過與膜上的手性分子相互作用進而殺死細菌的。

2.2　多肽抗生素對真菌的殺傷作用　許多多肽抗生素除了具有抗細菌的活性外，還具有抗真菌的作用。如來源于蛙類的PGQ，dermaseptin和哺乳動物的defensins對一些人類致病真菌具有殺傷作用，其中兔defensinNP-1對玉米的致病真菌也有作用。一些來源于植物的多肽抗生素，如植物defensins、thionins等對多種植物致病真菌具有殺傷作用。最近，Cavallarin等發(fā)現(xiàn)cecropin衍生物N末端α螺旋區(qū)域的11個氨基酸順序與抗真菌活力有關。

2.3　多肽抗生素對原蟲的作用　一些多肽抗生素可以有效地殺滅寄生于人類或動物的寄生蟲。如Shiva-I(一種cecropin的類似物)可以殺死瘧原蟲；一種cecropin/melittin的雜合肽可以殺傷萊什曼鞭毛蟲。

2.4　多肽抗生素對病毒的作用　目前發(fā)現(xiàn)多肽抗生素可以3種不同的機制起到抗病毒的作用。第1種是通過多肽抗生素直接與病毒粒子相結(jié)合而發(fā)揮作用。如α-defensins，modelin-1等對皰疹病毒的作用，polyphemusins對HIV病毒的作用。第2種是抑制病毒的繁殖，如mellitin和cecropin A 對HIV病毒的作用。第3種機制是通過模仿病毒的侵染過程而起作用。如melititn及其類似物K7I的結(jié)構與煙草花葉病毒核衣殼與mRNA相互作用的區(qū)域具有相似性，通過干擾病毒的組裝而對病毒產(chǎn)生作用。

2.5　多肽抗生素對癌細胞的作用　許多研究顯示與正常細胞相比腫瘤細胞對多肽抗生素更敏感，目前對引起這種差別的原因還不完全清楚，初步認為與以下幾個因素有關：①由于腫瘤細胞的高代謝引起細胞膜電位的改變；②腫瘤細胞膜外表面含有更高的酸性磷脂；③腫瘤細胞的細胞骨架或胞外基質(zhì)的變化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cecropin及其類似物，magainin2及其類似物，cecropinA-magainin2, cecropinA-melittin雜合肽及其類似物都對腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用。

3　多肽抗生素的合成

3.1　化學合成法　

為了研究多肽抗生素的作用機制，許多天然多肽抗生素及其類似物已通過固相合成的方法得到。其中研究最多的是具有雙親螺旋結(jié)構的帶正電荷的多肽。通過改變或增刪多肽某些位置的氨基酸，可以研究多肽抗生素一級結(jié)構的保守性。在研究該類多肽抗生素與細菌細胞膜的相互作用時，利用D-型氨基酸合成了天然多肽的對映體。天然多肽形成左手螺旋，而其對映體形成右手螺旋，發(fā)現(xiàn)D-型氨基酸形成的對映體與天然多肽具有相同的生物活性，從而進一步證明了雙親螺旋結(jié)構在該類多肽的生物活性中具有重要作用。為了尋找具有更高抗菌活性或更廣抗菌譜的多肽抗生素，一些雜合肽相繼被合成。例如，由cecropin和melititn的前13個氨基酸組成的雜合肽CN(1～13)MN(1～13)具有很強的抗菌活性而無溶血活性。為了節(jié)約成本，人們也在試圖尋找更短的具有抗菌活性的小肽�；瘜W合成法可以方便地在合成過程中改變多肽的一級結(jié)構，加入特殊氨基酸，對多肽末端進行修飾，但是昂貴的成本是限制該方法工業(yè)化應用的最大障礙。
3.2　基因工程合成法　

利用基因工程的方法生產(chǎn)多肽抗生素是降低生產(chǎn)成本的一條有效途徑。但是多肽抗生素對原核細胞的毒性在一定程度上限制了其在原核表達系統(tǒng)中的應用。而真核表達系統(tǒng)的較低表達效率也是其工業(yè)化生產(chǎn)的一個障礙。為了克服多肽抗生素對細菌細胞的毒性，人們采用融合表達或選擇對多肽抗生素具有抗性的株系進行原核表達。最早Jaynes于1989年在大腸桿菌中融合表達了Shiva-I基因。1993年，Piers等將defensin，HNP-1，cecropin/melittin雜合肽基因分別與4個不同的載體蛋白相融合，并在大腸桿菌中進行表達。對表達產(chǎn)物的產(chǎn)量、細胞定位、蛋白降解情況進行了較為系統(tǒng)的研究。對其中的一些融合蛋白進行化學裂解或酶解后，得到了具有抗菌活性的小肽。

1993年，Maeno 等利用鏈霉菌表達系統(tǒng)分泌表達了apidaecin的融合蛋白，裂解后得到了有活性的產(chǎn)物。1992年Reichhart等在酵母中成功表達了具有正確二硫鍵配對的綠蠅defensin A，產(chǎn)量最高可達每ml培養(yǎng)基2.5 μg。1991年，Andersons等利用多角體病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細胞系中表達了cecropinA的融合蛋白，C末端未見酰胺化，后來利用活體昆蟲進行表達，產(chǎn)量提高了60倍，并且部分產(chǎn)物被酰胺化。在國內(nèi)，謝維等在大腸桿菌中表達了家蠶多肽抗生素CMIV。1999年，沈俊卿等在酵母中表達了cecropin的類似物。

Tab 1　Therapeutic status of peptide antibiotics

4　多肽抗生素的應用及前景

4.1　多肽抗生素在醫(yī)藥工業(yè)中的應用及前景　

目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經(jīng)日益嚴重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一條有效途徑。多肽抗生素因為抗菌活性高，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，而被認為將會在醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應用前景。目前，已有多種多肽抗生素正在進行臨床前的可行性研究，其中magainins已經(jīng)進入三期臨床試驗階段。一些多肽抗生素在醫(yī)藥研究中的進展情況見Table 1。

現(xiàn)在大多數(shù)臨床試驗是用于局部治療，這種治療應該是安全和有效的，因為一些毒性更強的多肽和脂多肽，如短桿菌肽S，多粘菌素B已被用于制造皮膚軟膏。這些多肽也可用于那些常規(guī)抗生素和常規(guī)療法無效的地方。利用粉劑的方法治療肺部感染是一個很有前途的發(fā)展方向�？诜�藥物可能會被用于治療腸道感染，nisin正在進行抗螺旋桿菌的臨床試驗。至少有兩個公司正在開發(fā)非腸道給藥的治療方法。但是，多肽抗生素要真正用于臨床，必須首先要解決以下問題：多肽抗生素的毒性、穩(wěn)定性、免疫原性、應用方法、藥物配方。藥物配方是影響治療效果的一個主要問題。此外，體內(nèi)蛋白酶，尤其是胰蛋白酶對多肽的降解，不同組織器官對多肽的吸收情況都有待于進一步的研究。

4.2　多肽抗生素在其他方面的應用及前景　

由于某些多肽抗生素對一些植物致病細菌和真菌具有很強的抗性，一些多肽抗生素已經(jīng)被用于植物抗病基因工程。如Jaynes等將兩個cecropin的類似物基因，Shiva-I基因和SB-37基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)Shiva-I的轉(zhuǎn)基因煙草對青枯病具有一定的抗性，而SB-37的轉(zhuǎn)基因煙草沒有抗性。Huang 等的研究表明將cecropin類多肽MB-39基因與大麥α淀粉酶信號肽基因融合后轉(zhuǎn)入煙草中，所得植株對野火病的抗性增強。在國內(nèi)，黃大年等利用cecropinB基因轉(zhuǎn)化水稻，得到了一些對水稻細條病具有不同抗性的植株。

多肽抗生素動物轉(zhuǎn)基因的研究也已經(jīng)取得了一些進展，比如可以通過基因工程的方法來阻斷一些蟲媒疾病的傳播，Possani等［21］的研究表明，在蚊子體內(nèi)表達Shiva-3可以抑制瘧疾的傳播，但是在蚊子的轉(zhuǎn)基因技術方面還存在著一些困難；Durasula等通過在長紅獵蝽的共生菌中表達CecropinA明顯減少了其體內(nèi)錐蟲的數(shù)量。Reed等將Shiva-Ia轉(zhuǎn)入小鼠中，轉(zhuǎn)基因小鼠對布魯氏桿菌的抵抗力顯著增強，這為人工培育抗病飼養(yǎng)動物新品種提供了新思路。此外，多肽抗生素在食品防腐，鮮花保鮮和動物飼料添加劑等方面的應用研究也正在進展之中。