RIP 技術(shù)--研究腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中microRNA失調(diào)的有力工具

microRNAs（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，一般具有18到25個核苷酸，其序列在進(jìn)化上高度保守，通過靶向特定mRNA來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

miRNA是越來越受關(guān)注的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（post-transcriptional control）中重要的調(diào)控因子。首先，miRNA結(jié)合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）復(fù)合物中，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC），然后通過不完全的堿基互補(bǔ)靶向到目標(biāo)mRNA的3’UTR區(qū)，再通過引導(dǎo)酶切影響了mRNA的穩(wěn)定性，或直接阻礙翻譯過程，從而介導(dǎo)特異mRNA靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。

miRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA靶向到目標(biāo)mRNA的3’UTR區(qū)，抑制靶mRNA的蛋白表達(dá)。（摘自Chatterjee & Pal, Biol Cell. 2009）

miRNA對許多生理過程產(chǎn)生重要影響，如細(xì)胞生長、凋亡、應(yīng)激應(yīng)答、干細(xì)胞分化潛能的維持以及新陳代謝等。據(jù)估計(jì)，脊椎動物基因組編碼多達(dá)1000種不同的miRNA，研究人員推測，這些miRNA可能調(diào)控至少30%的基因的表達(dá)。盡管研究人員目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)超過530種miRNA，但仍需進(jìn)一步研究以了解這些分子的確切的細(xì)胞學(xué)功能，及其在疾病發(fā)生中所扮演的角色。

對miRNA的研究表明，miRNA表達(dá)量的上調(diào)或是下降都可能與致癌基因或是抑癌基因的調(diào)節(jié)有關(guān)，因此miRNA在癌癥生成中起重要的作用。通常而言，與發(fā)生分化了的細(xì)胞類型有關(guān)的miRNA在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)減少，而那些在早期發(fā)育及干細(xì)胞中便有所表達(dá)的miRNA卻保留下來。

一些在腫瘤中過度表達(dá)的miRNA通過下調(diào)抑癌因子而促進(jìn)腫瘤發(fā)生，如：
--在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的miR-21，靶向抑癌基因PTEN ；
--在淋巴瘤中高表達(dá)的miR-17-miR-92簇，靶向抑癌基因E2F1；
--在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中高表達(dá)的miR-372和miR-373，靶向抑癌基因LATS2。（摘自：Lujambio,AEsteller,M Cell Cycle 2009）

同時，一些在腫瘤中表達(dá)缺失的miRNA起著抑制癌癥的功能，如：
--在肺癌中中低表達(dá)的lethal-7（let-7）miRNA家族，靶向致癌基因KRAS、NRAS、MYC和high mobility group A2 (HMGA2)；
--在睪丸癌和套細(xì)胞淋巴瘤中低表達(dá)的miR-15a-miR-16-1簇，靶向致癌基因cyclin D1。

值得注意的是，這些miRNA的作用是組織和腫瘤特異性的，例如miR-155在白血病和淋巴癌中是高度表達(dá)的，并起著原癌基因的作用，而miR-155在內(nèi)分泌腫瘤中表達(dá)極大地下調(diào)，很可能對內(nèi)分泌腫瘤具有抑制作用。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA參與晚期癌癥的特征--癌細(xì)胞擴(kuò)散過程的調(diào)控，這些miRNA通過同時作用多條信號通路并靶向不同目標(biāo)蛋白基因而對癌細(xì)胞擴(kuò)散起激活或抑制的功能（詳見下圖）。

腫瘤轉(zhuǎn)移中miRNA調(diào)控的信號通路。在癌癥惡化過程中，通常表達(dá)上升的miRNA以紅色方框表示，而表達(dá)下降的miRNA以灰色方框表示。有助于上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的蛋白編碼基因以綠色方框表示。EMT：epithelial-mesenchymal transition，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化； ECM： extracellular matrix，胞外基質(zhì)。（摘自Nicoloso etc., Nature Rev. Cancer 2009）

由于miRNA被發(fā)現(xiàn)在癌癥機(jī)理中起重要的作用，尤其是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)，因此對于miRNA的研究來說，最讓人興奮的是有希望應(yīng)有于癌癥治療中的RNA 抑制療法或模擬miRNA表達(dá)療法，尤其是對于出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的癌癥病人的治療。

但是miRNA具有成百上千個靶標(biāo)，所以要完全理解一個miRNA和靶標(biāo)的特異性反應(yīng)與腫瘤發(fā)生之間的聯(lián)系，是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的工作，尤其是在癌癥研究中鑒別出miRNA的準(zhǔn)確靶點(diǎn)仍然是一大難題�，F(xiàn)已知道m(xù)iRNA的調(diào)節(jié)功能是通過結(jié)合不同的蛋白質(zhì)或RNA來實(shí)現(xiàn)的，因此研究miRNA與蛋白的結(jié)合情況對于揭示miRNA的功能及指導(dǎo)RNA療法的研發(fā)具有重要意義。Robert Nakamura博士是Advanced Genetic Systems公司的首席執(zhí)行官，作為驗(yàn)證RNA-蛋白復(fù)合物作為治療靶點(diǎn)有效性的專家，他認(rèn)為“我們知道RNA結(jié)合蛋白在不同的生理狀態(tài)下會結(jié)合不同的RNA。通過從細(xì)胞中分離完整的RNA-蛋白復(fù)合物，我們可以確認(rèn)分子間的特異性相互作用，從而有希望為治療疾病找到破壞這些相互作用的方法。”

RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。RIP這種新興的技術(shù)運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等）。RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。

Millipore基于磁珠的RIP實(shí)驗(yàn)流程:




RIP 實(shí)驗(yàn)基本原理：

• 用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白

• 防止非特異性的RNA的結(jié)合

• 免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來

• 結(jié)合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定

延伸閱讀：   95%的人類基因組并不編碼基因，而是產(chǎn)生大量的非編碼RNA，真正編碼蛋白質(zhì)的基因只占人類總基因組的約2%。這些非編碼RNA在生命的生長發(fā)育的各個階段都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，與艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多種病變密切相關(guān)，并且參與著干細(xì)胞和表觀遺傳學(xué)調(diào)控。而RNA-蛋白復(fù)合物驅(qū)動了幾乎所有細(xì)胞過程的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，包括剪接（splicing）、出核轉(zhuǎn)運(yùn)（nuclear export）、mRNA 穩(wěn)定性以及蛋白轉(zhuǎn)譯過程，因此，對基因調(diào)控的了解就有賴于確定這些過程中RNA的結(jié)合的變化。因此，RNA研究也被越來越多的科學(xué)家重視起來，目前已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中一個炙手可熱的領(lǐng)域，而RIP技術(shù)也逐漸成為RNA研究領(lǐng)域的一項(xiàng)常規(guī)方法，幫助我們了解越來越受關(guān)注的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。