流式細胞儀實驗方法

一、實驗準備
1． 標本制備：
2． 最小化非特異性結(jié)合：
二、凋亡
1．凋亡的檢測方法：網(wǎng)站和其它
2．PI染色法
3．Annexin V 法
4．TUNNEL法
三、細胞因子
1．激活的細胞因子
2．CBA
四、血小板
1．活化
2．活化檢測
3．網(wǎng)織血小板
五、紅細胞
1．網(wǎng)織紅細胞
2．PNH
3．胎兒紅細胞
六、腫瘤學
1．DNA 細胞周期
2．蛋白
3．多藥耐藥
4．微小殘留白血病

第一部分 標本處理

一、流式細胞術(shù)常規(guī)檢測時的樣品制備
(一)直接免疫熒光標記法
取一定量細胞(約1X106細胞／ml)，在每一管中分別加入50μl的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上(),再直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應(如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入)，。孵育20-60分鐘后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。本方法操作簡便，結(jié)果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。
(二)間接免疫熒光標記法
取一定量的細胞懸液(約1X106細胞／ml)，先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原—抗體—抗抗體復合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結(jié)果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。另外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數(shù)較少的標本。

二、最小化非特異性結(jié)合的方法
1．熒光標記的抗體的濃度應該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗體之前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清來作為標記的第二抗體。這個步驟通過阻斷第一抗體和細胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來降低背景。
3．在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標記的第二抗體一起培育。這個步驟會減少不必要的第二抗體與第一抗體、細胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。
通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標記過的抗體可以略過此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時候它也會導致已標記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復合體的形成。這種復合體會優(yōu)先與一些細胞結(jié)構(gòu)進行結(jié)合，或者它們最終會導致期望得到的抗體活性的丟失。
4．使用F(ab’)2片段會使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab’)2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細胞與正常血清一起培育應選擇優(yōu)先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。
5．其它：已標記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應也可能會有背景影響。為了降低背景，在多重標記過程中，所有的已標記的抗體應被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應。


第二部分 細胞因子

細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞儀檢測

一、簡介
隨著研究的進展，僅僅對細胞進行定量和活性的檢測已不能滿足需要。在單細胞水平研究細胞因子的表達能力對研究細胞因子在疾病中的作用越來越顯的重要無比。目前檢測單個細胞特定細胞因子的表達手段包括：ELIspot、原位雜交、免疫細胞化學、限制性稀釋分析（limiting dilution analysis，LDA）和單細胞PCR，應用原位雜交技術(shù)和免疫組化方法觀察細胞因子蛋白表達及mRNA表達可以識別Th1和Th2細胞，此方法可獲得較強的細胞內(nèi)信號，但此方法工作量大、主觀性強，難以進行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細胞PCR技術(shù)，技術(shù)性強、勞動強度大，難以進行廣泛推廣。隨著多標記及胞內(nèi)細胞因子標記流式細胞技術(shù)的出現(xiàn)，使對細胞內(nèi)細胞因子的研究推向了一個新的階段。下面主要對胞內(nèi)細胞因子流式細胞技術(shù)作以介紹。
　　早期細胞因子表達與細胞功能相關(guān)性研究是基于特定克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆證明了不同細胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－)與TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但這些研究很難外推，因為T細胞克隆與體內(nèi)T細胞功能相關(guān)性還未被揭示。
近來，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導的轉(zhuǎn)運的方法使得細胞因子聚集，蓄積，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。因為自然狀態(tài)下，T淋巴細胞產(chǎn)生少量的細胞因子，通常要對T淋巴細胞體外活化進行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細胞因子信號較弱，難以進行檢測。這一方法可檢測單個細胞內(nèi)多個細胞因子，并可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉(zhuǎn)。且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞(T、B、NK)不能分泌細胞因子。
胞內(nèi)流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內(nèi)特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。具有其它方法難以比擬的優(yōu)點：
Ø 快速：流式定量檢測細胞內(nèi)細胞因子可在一天內(nèi)完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時，快速簡便；
Ø 簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；
Ø 靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統(tǒng)；
Ø 高效：可以在同一個細胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據(jù)細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子的細胞的亞型，進行多參數(shù)相關(guān)分析；
Ø 安全：減少樣本處理與生物源性污染
Ø 接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環(huán)境更準確反映了體內(nèi)狀況。

二、所需儀器
1.流式上樣管及細胞培養(yǎng)皿或板
2.25%CO2，37℃孵箱
3. 混勻振蕩器
4.離心機
5.加樣器、Tips
6.流式細胞儀

三、常用的標本類型和處理方法
全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應將真空采血管水平室溫放置。
自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內(nèi)分析。
組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細胞(PBMCs)：用Ficoll分離PBMCs，將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106細胞/ml。
細胞系與T細胞克隆：調(diào)節(jié)細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。
冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。

四、所需試劑
1、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑
依據(jù)實驗需要選擇特殊表面標志
CD45圈定所有淋巴細胞
CD3 圈定T淋巴細胞
CD4 圈定T輔助淋巴細胞亞群
CD8 圈定T抑制淋巴細胞亞群
CD19/或CD20圈定B淋巴細胞
CD56圈定NK淋巴細胞
CD14圈定單核細胞
2、熒光標記的細胞因子抗體：R&D提供FITC、PE和APC標記的細胞因子抗體
3、溶血素：用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333）溶解紅細胞
4、激活劑
①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目錄號ALX-445-004-M001）
A.DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL
B.分裝(20L)，－20℃儲存。勿反復凍融
C.每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液
D.PMA終濃度25ng/mL細胞懸液
②Ionomycin （Alexis,目錄號ALX-450-006-M001）
A.于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL
B.－20℃儲存
C.每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
D.Ionomycin終濃度1g/mL細胞懸液
③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)
A.無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL
B.4℃儲存
C.SEB終濃度10g/mL細胞懸液
④CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞
⑤CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應，濃度一般為10ug/ml
5、阻斷劑
阻斷高爾基體介導的轉(zhuǎn)運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內(nèi)
① Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目錄號00-4506）
A. 于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL
B. 分裝(20L)，-20℃儲存。勿反復凍融。
C. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
D. 激活最后4－5小時BFA終濃度10g/mL細胞懸液。
注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降
② Monensin （eBioscience，目錄號00-4505）
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、 固定劑：細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細胞因子固定在細胞內(nèi)，另一方面避免細胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號00-8222）
8、 破膜劑：含1％皂甙、0.05％疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號00-8333）
將細胞膜穿孔，已利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內(nèi)，于相應的細胞因子結(jié)合
9、其它試劑：無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。

五、細胞培養(yǎng)和刺激的基本方法
細胞活化的最終結(jié)果是產(chǎn)生細胞因子，根據(jù)檢測指標和標本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺激時間，以獲得最佳的實驗結(jié)果。下表提供了檢測一些常用細胞因子的推薦的活化方法。

表1、細胞內(nèi)細胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法

為防止細胞內(nèi)細胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的最后4-6個小時，需要使用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)
方法1: 只使用轉(zhuǎn)染細胞檢測
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小時.
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小時.
方法4: 人的PBMCs或者純化的CD4＋細胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10 ng/ml，目錄號202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目錄號204-IL-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后收獲細胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小時
方法5: CD4+ T 細胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 細胞使用抗CD3 的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs細胞使用重組人IFN (10 ng/ml，目錄號285-IF-100) 刺激2 小時，然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小時或者使用相同的方法刺激THP-1 細胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗體(25 ug/ml) 的培養(yǎng)板中，使用抗CD28 抗體(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小時
方法10: CD4＋T細胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗體，重組小鼠的IL-2（10 ng/ml，目錄號402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目錄號404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；最后收獲細胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小時。
方法11: 小鼠ip巨噬細胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時
方法12: 小鼠脾細胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小時