伯豪生物華南區(qū)銷售技術(shù)團(tuán)隊(duì)在研究過(guò)程中的通力合作也得到了陸教授團(tuán)隊(duì)的認(rèn)可,伯豪生物會(huì)更加努力協(xié)助更多老師取得更大的科研成果。
研究背景:
系統(tǒng)性紅斑狼瘡,俗稱蝴蝶病,是一種以過(guò)量產(chǎn)生多種自身抗體和多器官受累為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病;颊唧w內(nèi)存在多種自身抗體,抗體與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物沉淀在靶組織中,引起一系列炎性介質(zhì)釋放,從而造成器官組織的損傷。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)路線:
差異甲基化位點(diǎn)篩選
實(shí)驗(yàn)方法:Infinium Human Methylation 450 BeadChips (Illumina)
樣本類型:外周血DNA
樣本數(shù)量:3例活動(dòng)期患者 vs 3例正常對(duì)照;
3例穩(wěn)定期患者 vs 3例正常對(duì)照;
顯著差異CpG位點(diǎn)篩選:|avg. Δβ|>0.1,且 p value < 0.05;
活動(dòng)期患者 vs 健康對(duì)照
顯著差異CpG數(shù)量:2099個(gè)基因中 3719 CpG位點(diǎn)
穩(wěn)定期患者 vs 健康對(duì)照
顯著差異CpG數(shù)量:539個(gè)基因中 983 CpG位點(diǎn)
選擇IFI44L作為候選標(biāo)志物的原因:
1. IFI44L的所有顯著差異CpG位點(diǎn)均位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp范圍和5’-UTR區(qū)域內(nèi);
2. IFI44L_cg06872964檢測(cè)到的CpG位點(diǎn)在活動(dòng)期患者和穩(wěn)定期患者外周血DNA中甲基化水平都顯著低于健康對(duì)照。
3. 課題組之前研究結(jié)果也曾發(fā)現(xiàn),在紅斑狼瘡患者的CD4+細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中IFI44L基因啟動(dòng)子都呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。
IFI44L是一種干擾素刺激基因,也就是能被干擾素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因。早期研究發(fā)現(xiàn)其有一定的抗丙肝病毒活性,最近研究還發(fā)現(xiàn)病毒感染會(huì)引起人外周血單核細(xì)胞IFI44L基因表達(dá)上調(diào)。
接下來(lái),研究人員開始針對(duì)IFI44L啟動(dòng)子區(qū)特殊CpG位點(diǎn),即芯片中cg06872964探針覆蓋的2個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行了大樣本量的焦磷酸測(cè)序檢測(cè),作為探究該CpG位點(diǎn)是否可作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)志物的依據(jù)。
后期驗(yàn)證:共有 4210 個(gè)患者和志愿者參與了后期的驗(yàn)證工作。
探索組驗(yàn)證 (驗(yàn)證中國(guó)患者對(duì)候選標(biāo)志物的特異性和敏感性)
實(shí)驗(yàn)方法:焦磷酸測(cè)序 (Pyrosequencing)
樣本類型:外周血DNA
樣本數(shù)量:
377例紅斑狼瘡患者 vs 358例正常對(duì)照
353例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者 vs 358例正常對(duì)照
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
在紅斑狼瘡患者的外周血單核細(xì)胞DNA中,Site 1和Site 2這兩個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平明顯低于健康對(duì)照和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。
驗(yàn)證組 1 (驗(yàn)證中國(guó)患者對(duì)候選標(biāo)志物的特異性和敏感性)
實(shí)驗(yàn)方法:焦磷酸測(cè)序 (Pyrosequencing)
樣本類型:外周血DNA
樣本數(shù)量:
529例紅斑狼瘡患者 vs 569例正常對(duì)照
429例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者 vs 569例正常對(duì)照
199例原發(fā)性干燥綜合癥 vs 569例正常對(duì)照
驗(yàn)證組 2 (驗(yàn)證歐洲患者對(duì)候選標(biāo)志物的特異性和敏感性)
實(shí)驗(yàn)方法:焦磷酸測(cè)序 (Pyrosequencing)
樣本類型:外周血DNA
樣本數(shù)量:615例紅斑狼瘡患者 vs 781例正常對(duì)照
IFI44L啟動(dòng)子甲基化與臨床特征的關(guān)系
將906例中國(guó)紅斑狼瘡患者,按照臨床特征分成290例腎損害和616例無(wú)腎損害兩組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴有腎損害的患者IFI44L啟動(dòng)子甲基化水平明顯低于無(wú)腎損害的患者。
另外,研究人員還分別對(duì)30例紅斑狼瘡患者的癥狀活動(dòng)和緩解時(shí)期的血液樣本DNA中2個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平作了比較,其中86.67% (26/30)和66.67% (20/30) 的患者在緩解期的甲基化水平要高于活動(dòng)期。
研究進(jìn)行到這里,雖然說(shuō)就已經(jīng)可以證明IFI44L啟動(dòng)子甲基化水平是一種特異性高、敏感性強(qiáng)的系統(tǒng)性紅斑狼診斷標(biāo)志物,但仍不清楚IFI44L甲基化水平變化的原因。
因?yàn)橄到y(tǒng)性紅斑狼瘡患者最顯著的一個(gè)特征就是外周血單核細(xì)胞中受Ⅰ型干擾素調(diào)節(jié)的基因異常持續(xù)過(guò)量表達(dá),即所謂“干擾素標(biāo)記”現(xiàn)象。而且考慮到IFI44L本就是一種干擾素刺激基因,所以研究人員首先懷疑是否可能是由于紅斑狼瘡患者體內(nèi)Ⅰ型干擾素過(guò)量表達(dá)才觸發(fā)紅斑狼瘡患者IFI44L啟動(dòng)子的甲基化水平降低。
為了弄清楚這個(gè)疑惑,研究人員采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法,分別從系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康對(duì)照的20ml外周血中分離得到外周血單核細(xì)胞。研究人員將單核細(xì)胞置于在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng), 同時(shí)用1000 U/L 干擾素-α 刺激單核細(xì)胞。焦磷酸測(cè)序結(jié)果顯示在單核細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,即便研究人員使用干擾素-α對(duì)單核細(xì)胞刺激的時(shí)間達(dá)到48小時(shí),但作為診斷標(biāo)志物的IFI44L基因兩個(gè)CpG位點(diǎn)在患者和健康對(duì)照兩組的甲基化水平都沒(méi)有發(fā)生明顯變化,也就表明并不是由于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)干擾素-α升高才導(dǎo)致患者IFI44L基因的甲基化水平降低。
本文中的450K甲基化芯片服務(wù)以及焦磷酸測(cè)序服務(wù)均由上海伯豪生物技術(shù)服務(wù)有限公司提供。
原文出處:
Zhao M, Zhou Y, Zhu B, Wan M, Jiang T, Tan Q, Liu Y, Jiang J, Luo S, Tan Y, Wu H, Renauer P, Del Mar Ayala Gutiérrez M, Castillo Palma MJ, Ortega Castro R, Fernández-Roldán C, Raya E, Faria R, Carvalho C, Alarcón-Riquelme ME, Xiang Z, Chen J, Li F, Ling G, Zhao H, Liao X, Lin Y, Sawalha AH, Lu Q. IFI44L promoter methylation as a blood biomarker for systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 19 January 2016 [PMID: 26787370 ]